Вес фбс блоков: Масса ФБС блоков

Содержание

Блоки ФБС — размеры, маркировка, марка бетона, вес. Какие ФБС можно ку

В предыдущих материалах нашего блога мы рассказывали о типах фундаментных стеновых блоков (ФБС), о местах их применения, классификации и марках бетона, который используется при изготовлении блоков ФБС на заводах ЖБИ в Рязани. В этой статье вы найдете данные о размерах блоков ФБС, которые компания ЦемСтрой поставляет клиентам от завода производителя — рязанского завода ЖБИ 2.

Итак, чтобы выбрать размеры и формы бетонных блоков ФБС, необходимо знать тип будущего строения (оценить нагрузку на блоки), качество грунта и климатические условия эксплуатации. В зависимости от этих факторов, ваша проектная или строительная организация выберут подходящие по техническим и эксплуатационным характеристикам блоки ФБС, произведенные по ГОСТ на заводах ЖБИ.

Скачайте на компьютер или смартфон сводный pdf файл, где представлены развернутые характеристики следующих блоков ФБС:

ФБС 24.3-6т
ФБС 24.4-6т
ФБС 24.5-6т
ФБС 24.6-6т
ФБС 12.3-6т
ФБС 12.4-6т
ФБС 12.5-6т
ФБС 12.6-6т
ФБС 9.3-6т
ФБС 9.4-6т
ФБС 9.5-6т
ФБС 9.6-6т
ФБС 12.4-3т
ФБС 12.5-3т
ФБС 12.6-3т
ФЛ 20.24-3
ФЛ 20.12-3

Скриншот pdf-файла:

Отдельное обращение тем, кто планирует купить блоки ФБС б/у для будущего дома. Профессиональные строители не рекомендуют покупать б/у фундаментные блоки, так как условия их хранения, эксплуатации и производства (вы не можете быть уверены, что эти блоки были изготовлены по ГОСТ в заводских условиях) могли оказать существенное влияния на эксплуатационные характеристики изделий в худшую сторону. А это значит, что экономная, на первый взгляд, покупка б/у блоков ФБС может закончиться неприятной ситуацией.

Выбирая качественные блоки ФБС — вы выбираете спокойствие за безопасность близких людей.

Скачать прайс-лист на блоки ФБС можно тут

Получить дополнительную консультацию по размерам и покупке блоков ФБС с доставкой в Рязани:

(4912) 777-903

#блокифбсрязань #купитьблокифбс #цемстройрязань

ФБС 24.4.4

Блоки ФБС 24.4.4 — бетонные фундаментные блоки широкого назначения, производятся согласно ГОСТ 13579-78 из тяжелого бетона класса В 7.5 (М100). Применяются для устройства прочного фундамента как жилых, так и производственных зданий, при строительстве подвалов, гаражей, складских помещений, для возведения стен, а иногда и в качестве преград при дорожном строительстве.

Основная задача фундаментных блоков ФБС — равномерное распределение нагрузки от каркаса здания по всему периметру грунтового пласта, поэтому крайне важно перед началом закладки фундамента определить тип почвы и грунта, проверить уровень и глубину промерзания в зимний период, определить место пролегания подземных вод и сделать расчет по ожидаемой нагрузке на фундамент (с запасом для безопасности). На основе этих данных готовится проект, в котором учитываются все нюансы раскладки фундаментных блоков и подушек, которые, к слову, обеспечивают надежность закладываемого фундамента. Помимо этого, необходимо сделать правильную гидроизоляцию фундаментных блоков, чтобы избежать агрессивного воздействия грунтовых вод, поэтому блоки покрываются битумом.

ФБС 24.4.4 идеально подходят для закладки ленточного фундамента, который представляет собой железобетонные полосы, идущие по периметру всего здания. Устройство ленточного фундамента подходит для домов с бетонными стенами; для домов с монолитными, сборными железобетонными и металлическими перекрытиями; для домов, где планируется подвал или цокольный этаж; а так же в тех случаях, когда существует угроза неравномерных осадок фундамента из-за неоднородности грунтов на участке. Ленточный фундамент из блоков ФБС 24.4.4 применяют в сильно пучинистых и влагонасыщенных грунтах, потому что он сработает как одно целое, перераспределит усилия и стены дома не дадут трещин и деформаций.

Аббревиатура ФБС расшифровывается как «фундаментный блок сплошной»
. Первая цифра в маркировке означает длину в дециметрах, вторая — ширину, а третья — высоту. Буква «Т» обозначает, что блок изготовлен из тяжелого бетона.

Сфера применения

Главная цель использования фундаментных блоков ФБС — это создание прочной и надежной опоры для постройки. Грамотно установленные ЖБИ данного типа предохраняют помещение от влаги и гниения. Бетонные блоки не деформируются со временем и отлично выдерживают воздействие грунтовых вод, так как отличаются низким водопоглощением. На поверхность блоков наносится битум, защищающий их от разрушения. Швы между блоками заполняются цементным раствором. Таким образом, железобетонные блоки ФБС используют в тех случаях, когда необходимо выдержать высокие нагрузки от стен здания на грунтовых поверхностях.

Фундаментные блоки ФБС являются идеальным материалом для подвальных и технических помещений. Помимо этого, они могут быть использованы для дачного строительства, в котором заливка фундаментной конструкции не может быть произведена вручную. Монтаж фундаментных блоков производится с помощью спецтехники. Для подъема на высоту применяются монтажные петли. Захват блоков осуществляется однорогими крюками с защелкой. Использование данного вида ЖБИ сокращает строительство объекта вдвое.

Габариты блоков ФБС 24.4.4

Длина – 2380 мм (с округлением значения до целого числа, т.к. длина вышеуказанного блока 2380 мм)
Ширина – 400 мм (с округлением значения до целого числа, т.к. ширина составляет 400 мм)
Высота – 380 мм (с округлением значения до целого числа, т.к. высота составляет 380 мм)
Масса – 0.860 т
Класс бетона по прочности на зажатие – В7.5
Марка бетона по прочности на зажатие – М100
Технические условия
– ГОСТ 13579-78

Технические характеристики

Блоки ФБС из тяжелого бетона обладают высокими техническим характеристиками, благодаря чему не поддаются деформации. Они имеют повышенные показатели к морозоустойчивости, влагоустойчивости и агрессивной среде, поэтому спокойно выдерживают широкий диапазон температур, чем могут похвастаться далеко не все ЖБИ.

Такие изделия не крошатся, не гниют, не выделяют токсичных веществ и устойчивы к коррозии. Выгода от использования тяжелого бетона обуславливается еще и тем, что благодаря своей солидной массе фундаментный блок будет более прочным, долговечным и устойчивым. Армирование блоков осуществляется крайне редко, при этом используется стальная углеродная проволока класса А1 и А111. Но такая конструкция быстрее приводит фундаментные блоки в негодность.

Проверка качества фундаментных блоков происходит поэтапно:

Сначала оценивается состояние и качество бетона. Выбраковке подлежит изделие, в котором имеются трещины, не соответствующие стандартам. Допускаются только поверхностные трещины, шириной не более 0.3 мм, которые могут возникнуть в результате усадки бетонной смеси;

Готовый для монтажа блок отвечает определенным габаритам, обозначенным в проектных чертежах. Его поверхность должна быть плоской и гладкой. Отклонения по размерам не могут превышать 13 мм по длине, 8 мм по ширине и высоте, 5 мм по размерам вырезов. Отклонения по прямолинейности профиля не может превышать 3 мм на всю длину и ширину блока;
Поверхность изделия, которое допускается в дальнейшую эксплуатацию, должна быть без существенных дефектов. Имеющиеся углубления и наплывы, образование которых невозможно избежать на стадии производства, не должны превышать 15 мм. Небольшие дефекты можно будет замазать бетонной смесью, непосредственно перед установкой. Блоки ФБС могут иметь несколько типов поверхности — лицевую, под покраску; лицевую, под отделку с применением керамических плиток; лицевую, без отделки; нелицевую, которая не видна в условиях эксплуатации;

Особым условием пригодности фундаментного блока для дальнейшей эксплуатации является наличие технического паспорта (сертификата качества). В нем указывается вся информация о готовом изделии, технические параметры, дата производства, маркировочная формула, морозостойкость и водонепроницаемость. Кроме этого, наличие технического паспорта является обязательным условием при транспортировке и хранении изделия. Помимо этого на боковую поверхность блоков всегда наносятся маркировочные знаки.

Хранение и доставка

Готовые блоки рекомендуется укладывать штабелями, плотно подгоняя друг к другу. Между блоками укладываются деревянные прокладки. Толщина прокладок должна быть не менее 30 мм. Поверхность, на которой расположены нижние блоки, должна быть тщательно выровнена. Сортировку следует производить по маркам с партиям изделий. Транспортировка блоков производится с надежным закреплением, предохраняющим их от смещения.

Компания «ДСК-Столица» доставляет фундаментные блоки ФБС 24.4.4 посредством транспортных компаний, соблюдая установленные требования транспортировки.

размеры и вес — Всё про бетон

Общая характеристика ФСБ блоков

ФБС по-иному еще называют Фундаментальные Блоки Стен. Длина этих блоков составляет 24 дециметра, ширина – три дециметра, а высота – шесть дециметров. Этот вид бетона не из легких. Такой вид блоков применяют как для строительства фундаментов, а также и для возведения стен в невысоких зданиях.

Для того, чтобы сделать такие блоки, применяют разные классы бетона – В 7,5, М-100, М-200, М-150. Все зависит от эксплуатации. Доставить блоки можно самостоятельно.

Что касается изготовления блоков, то их изготовляют исключительно в условиях завода. Все качество материала контролируется при помощи специальных лабораторных инструментов. Стоит учесть, что нигде не продаются использованные блоки.

Особенности блоков ФБС

Самым главным элементом в здании есть фундамент. Именно от качества фундамента зависит срок строительства дома. Для того, чтобы фундамент был прочным, и не быстро не развалился надо, чтобы хорошо схватился раствор.

Однако, такой метод кладки фундамента считается слишком длительным. Поэтому, в таком случае можно применить специальные блоки. Благодаря таким блокам, можно сразу же после строительства фундамента приступать к возведению стен. Для строительства фундамента зачастую применяют ФБС блоки.

Установка фундаментальных блоков

Прежде чем делать монтаж ФСБ блоков, для начала надо приготовить основания. В качестве основания можно применять плиты ленточного вида фундамента. Именно на ленточные плиты будет идти основная нагрузка. Для того, чтобы делать монтаж фундаментных плит надо для начала выровнять и утрамбовать основание.
Кроме этого, чтобы установить ФБС блок, можно использовать специальную подушку для фундамента . Чтобы сделать специальную подушку для фундамента, используют песок. Для этого, на дно фундамента необходимо насыпать песок толщиной десять сантиметров, и затем утрамбовать. После чего, делают подушку для фундамента высотой в тридцать сантиметров. А если дополнительно сделать армирование фундамента, тогда его прочность будет высшее в несколько раз. Эта подушка может быть посредством между фундаментом и блоками.
Монтаж блоков для фундамента можно делать на бетон, а также на раствор из цемента. Чтобы заполнить швы, которые получились, можно заделать раствором из цемента.

При кладке блоков надо обращать внимание на швы между блоками. Ширина между швами блоков должны составлять не более четырех сантиметров.

Стоит учесть, что для того, чтобы установить ФБС блоки, надо, чтобы работала бригада специалистов и кран. Когда фундамент будет сделан, и швы заделанные, можно приступать к процессу гидроизоляции фундамента.

Достоинства блоков ФБС

Данные блоки имеют множество преимуществ:

не надо брать в аренду специальную технику, чтобы сделать строительство из блоков ФБС;
если собрали конструкцию из блоков, то нет необходимости их разбирать, как это может быть с монолитными блоками;
благодаря легкости материала, строительство помещений повышается в несколько раз;
строительство помещений с применением этих блоков можно делать ежегодно, поскольку температура не влияет на качество материала;
сразу же после укладки этих блоков, можно приступать к иным монтажным работам.

Стоит обратить внимание, что более выгодно применять блоки ФБС для строительства небольших помещений.

Недостатки блоков ФБС

Как и все строительные материалы, ФБС блоки тоже имеют свои недостатки:

этот материал из дорогих. Но, если предстоит выбор блоков ФБС или монолитная плита, то, естественно, лучшее выбрать блоки;
также, стоит отметить, что в месте стыка блока никогда не будет герметичности;
при строительстве цокольного этажа необходимо нанимать специальную технику, и нескольких рабочих.

Выбор ФБС блоков для строительства

От того, как правильно вы выберете материал, зависит качество вашего будущего дома. Выбирая ФБС блоки, прежде всего, надо обратить внимание на паспорт продукции, который должен быть у продавца обязательно. Особенно, наличие паспорта важно, если вы собираетесь покупать большое количество продукции.

В паспорте для продукции надо чтобы было указано:

необходимая информация о заводе, на котором были деланы блоки;
номер регистрации, и номер партии;
все необходимая информация о блоке – вес, размер и тому подобное;
прочность материала, стойкость к температуре;
эксплуатация ФБС блока.

Если вы хотите купить блоки для цоколя, тогда надо выбирать несколько изделий, и сделать их замеры. По размерам, блоки должны быть одинаковыми. По словам специалистов, есть некоторые заводы, которые делают не стандартные размеры блоков.

Поэтому, по размерам, блоки ФБС отличаются друг от друга на шесть миллиметров. Если же отклонения намного больше, чем шесть миллиметров, в таком случае, лучшее отказаться от покупки материала.

Иначе надо будет тратить еще деньги на отделку и устройство цоколя. Кроме этого, надо спросить у продавца, подойдут ли эти блоки для цоколя или нет.

Малогабаритные блоки ФБС

По стандарту, выпускают этот материал двух размеров – 400 миллиметров, и 600 миллиметров, которые применяются для строительства негабаритных помещений. Также, некоторые специалисты предлагают применять более тяжелые блоки – 400 на 200 и на 200 миллиметров. Но, тяжелые блоки применят для строительства конструкции – из пеноблока или дерева.

К нестандартным блокам относятся фундаментальные ФБС блоки. Сегодня, этот вид блоков становится все более популярным.

Стоит учесть, что этот вид блоков можно применять для:

Возведения стен для подвалов и погреба.
Возведения столбчатых оснований, в большинстве для дачных домиков.
Комбинации с ленточным фундаментом.

Малогабаритные блоки делают из самых тяжелых марок бетона. Благодаря такому изготовлению, материал становится более прочным, и можно возводить стены на любую высоту.

Зачем необходимо знать массу блоков для фундамента?

Кроме габаритных размеров ФБС блоков по ГОСТ, еще существуют и массы для нормы. Такой вид блоков обязателен, чтобы можно было контролировать качество материала.

Также, параметры материала необходимы для того, чтобы правильно подобрать технику для укладки и транспортировки. Благодаря знанию всех необходимых данных блоков, можно быть уверенным, что рок службы построенного дома будет долгим.

Применение ФБС блоков для ленточного фундамента

Сегодня, практически каждый второй коттедж построен на ленточном фундаменте, который имеет долгий срок службы, прочный и имеет хорошие характеристики.

В большинстве случаев, ленточный фундамент заливают монолитным бетоном. Однако, если создать фундамент надо в кратчайшие сроки, тогда применяют блоки ФБС.

Конструкцию можно сделать за несколько дней, а раствор, который применяется для склеивания материала между собой, высыхает за несколько часов. Если сравнить блоки ФБС с обычным бетоном, то блоки не только быстрее высыхают, но и практичнее.

Стоит учесть, что если применять блоки для фундамента, то для возведения конструкции надо применять более тяжелую технику.

Главные особенности ленточного фундамента из блоков ФБС

Специальные фундаментные блоки — это изделия прямоугольной формы, которые укрепляются при помощи арматуры. Для того, чтобы создавать шов из блоков было легче, по их бокам есть небольшие ямки.

На производстве ФБС блоки делают из легкого и тяжелого бетона. Кроме этого, их создают из бетона, в составе которого присутствует керамзит. Кроме этого, изделия делят на несколько видов. Все зависит от того, какой именно арматурой их будут крепить – обычной либо закаленной.

К достоинствам ленточного фундамента с применением ФБС блоков можно отнести:

Такие блоки могут выдержать даже самые большие нагрузки, что никогда не сравнится монолитом.
Устойчив к перепадам климата, а также к окружающей среде.
Благодаря минимальной пористости, на полу никогда не будет плесени.

Стоит ли строить дом из ФБС блоков?

Кроме того, что ФБС блоки применяют в качестве фундаментных блоков, все же они могут применяться и для возведения стен. Если нет иного материала для возведения стен, например, кирпича или газобетона, то в таком случае можно применить блоки ФБС.

Во время укладки блоков для возведения стен, стоит учесть, сто их надо хорошо перевязывать, а также делать прочное армирование всех швов между блоками. Армирования делается способом особой сетки из металла, которую необходимо укладывать прямо в раствор.

Плюсы при строительстве дома из блоков ФБС:

Не надо много денег на покупку специального материала.
Материал имеет высокую прочность. Поэтому, крепкими будут не только фундамент, но и стены.
Нет ограничений по поводу выбора отделочной работы. Поэтом, можно применять все, что вы желаете.
Этот материал является хорошим утеплителем. Поэтому, дополнительно стены дома можно не утеплять.

Недостатки строительства дома с применением ФБС блоков:

Для того, чтобы строить дом с применением этих блоков, необходимо подбирать специальный участок. Ни в коем случае нельзя строить дом на грунте, который топчется.
Чем прочнее материал, тем высшее его стоимость.
Для строительства дома с применением блоков, надо использовать специальную технику, например, кран.

Поэтому, если вам надо блоки ФБС, которые практически доступны по стоимости, тогда можете заказать практически в любой строительной компании. Тем более, что компании делают доставку сами. Доставку производят в любые точки страны. Однако, в стоимость материала не входит в стоимость доставки, поскольку доставка оплачивается отдельно.

Линия наступления

| Руководство по позиционированию в футболе

Измеряемые физические параметры:

Высота: 6’5 «
Вес: 280 фунтов.

Статистика:

40 ярдов: 5.0
Скамья: 320 фунтов.
Приседания: 450 фунтов.

Ключи от автобуса:

Доминирует в LOS и кладет игроков HS на спину. Может перемещать линию схватки на 5 ярдов по желанию. С легкостью перебирается на второй уровень и побеждает в космосе.Показывает отличный баланс, редко на земле. Играет с отличным уровнем пэда, демонстрируя отличный сгибание в коленях. Играет с отличной естественной широкой базой. Демонстрирует способность естественно проходить декорации, скользить и с легкостью отражать. Может поддерживать равновесие при беге и может поражать движущиеся цели в поле. Игрок типа All-State, All Area / District с национальным вниманием со стороны рекрутинговых СМИ. Обычно это многократный выбор Все конференции.

Измеряемые физические параметры:

Высота: 6’3 «
Вес: 270 фунтов.

Статистика:

40 ярдов: 5.2
Скамья: 305 фунтов.
Приседания: 425 фунтов.

Ключи от автобуса:

, возможно, не продемонстрировал постоянного доминирования элитного новобранца FBS Power 5 калибра, но тренеры этого уровня по-прежнему будут учить атлетических линейных атакующих старшеклассников, поскольку они верят, что могут развить их с годом красной рубашки и хорошей программой силы и кондиционирования. Мигает способность доминировать в зоне видимости и сбивать игроков HS на землю.Может регулярно переходить на второй уровень. Мигает способность перемещать линию схватки. Мигает способность добивать блоки. Обладает хорошим балансом, редко на земле. Играет с отличным уровнем подушки, демонстрируя хорошее сгибание в коленях. Играет с хорошей натуральной широкой базой. Показывает способность передавать набор, слайд и зеркало. Может поражать движущиеся цели в поле. Игрок типа All Area / District. Обычно это многократный выбор Все конференции.

Измеряемые физические параметры:

Высота: 6’2 «
Вес: 260 фунтов.

Статистика:

40 ярдов: 5,3
Скамья: 300 фунтов.
Приседания: 410 фунтов.

Ключи от автобуса:

Дает возможность доминировать в зоне прямой видимости и сбивать игроков HS на землю. Может регулярно переходить на второй уровень. Мигает способность перемещать линию схватки. Обладает хорошим балансом, редко на земле. Играет с отличным уровнем подушки, демонстрируя хорошее сгибание в коленях. Играет с хорошей натуральной широкой базой.Показывает способность передавать набор, слайд и зеркало. Может поражать движущиеся цели в поле. Игрок типа All Area / District. Обычно это многократный выбор Все конференции.

Измеряемые физические параметры:

Высота: 6’1 «
Вес: 240 фунтов.

Статистика:

40 ярдов: 5,4
Скамья: 295 фунтов.
Приседания: 405 фунтов.

Ключи от автобуса:

Мигает возможность перемещения LOS.Можно попасть на второй уровень. Показывает хороший баланс, держится над землей. Играет с твердой подушкой, демонстрируя приличный сгибание в коленях. Может проходить набор и двигать ногами. Стремится к мячу. Как правило, выбор всех конференций или стартера университета.

Измеряемые физические параметры:

Высота: 6’1 «
Вес: 240 фунтов.

Статистика:

40 ярдов: 5,4
Скамья: 295 фунтов.
Приседания: 405 фунтов.

Ключи от автобуса:

Мигает возможность перемещения LOS. Можно попасть на второй уровень. Показывает хороший баланс, держится над землей. Играет с твердой подушкой, демонстрируя приличный сгибание в коленях. Может проходить набор и двигать ногами. Стремится к мячу. Как правило, выбор всех конференций или стартера университета.

Клеммные блоки

Инструменты и аксессуары FBS 4-5 4 POS BRIDGE (1 штука): Amazon.com: Инструменты и товары для дома

В настоящее время недоступен.
Мы не знаем, когда и появится ли этот товар в наличии.

Количество контактов	4
Размеры изделия ДхШхВ	6 х 4 х 6 дюймов
Спецификация соответствует	Поз

]]>

Характеристики данного продукта

Вес изделия	1.00 фунтов
Номер детали	3030187
Соответствие спецификации	Поз
Код UNSPSC	3 29

Инкапсуляция низкомолекулярного гепарина (бемипарина) в полимерные наночастицы, полученные из катионных блок-сополимеров: свойства и активность клеток

Наночастицы, нагруженные бемипарином (фракционированным низкомолекулярным гепарином), получали двумя последовательными эмульсиями в / в и превращением эмульсии в / в для различных полимерных систем в качестве составов с контролируемым высвобождением.Новые синтетические блок-сополимеры, поли (метилметакрилат- b -триметиламиноэтилметакрилат) (PMMA- b -PMAETMA), с контролируемой микроструктурой и молекулярной массой, были получены методом полимеризации RAFT (обратимое присоединение-фрагментация с передачей цепи), создавая набор полимеров с разным количеством катионных зарядов. Для сравнения использовали небиоразлагаемый положительно заряженный полимер Eudragit® RS PO и биоразлагаемый полимер поли (молочная со -гликолевой кислотой) PLGA.Микроструктурное расположение последовательностей MMA и MAETMA в PMMA- b -PMAETMA приводит к самоорганизующимся наночастицам ядро-оболочка в воде с положительно заряженной поверхностью, которые взаимодействуют с бемипарином. Составы оценивали с точки зрения размера частиц, дзета-потенциала и морфологии с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Захват молекул бемипарина подтверждался отрицательно увеличенным значением дзета-потенциала и обнаружением сигнала серы с помощью энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDAX).Достигнута высокая эффективность капсулирования для всех полимерных матриц от 89 до 98%. Системы, приготовленные с синтетическими блок-сополимерами PMMA- b -PMAETMA и PLGA, показали более высокое высвобождение бемипарина in vitro , чем системы Eudragit® RS PO. Для каждого препарата бемипарин, высвобожденный из наночастиц, сохранял свою биологическую активность, как показывает анализ пролиферации клеток BaF32 в присутствии фактора роста фибробластов (FGF2).

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Пожизненные кислородные датчики на основе блок-сополимерных мицелл и нековалентных аддуктов человеческого сывороточного альбумина, несущих фосфоресцентный комплекс иридия (III) в ближней инфракрасной области

В настоящем отчете мы описываем мицеллы блок-сополимера на основе поли (диметилсилоксана-, блока -этилена) гликоль), PDMS ₁₅— b -PEG ₁₁₀ , или поли (ε-капролактон- блок -этиленгликоль), PCL ₄₅— b -PEG ₁₁₀ , загружен фосфоресцентным комплексом иридия (III) в ближней инфракрасной области (NIR) ( Ir1 ) типа [(N ^ C) ₂ Ir (N ^ N)] ⁺, где N ^ C циклометаллирует 6- (бензо [b] тиофен-2-ил) фенантридиновый лиганд и N ^ N представляет собой бидентатный дииминовый (1- (пиридин-2-ил) -1H-1,2,3-триазол-4-ил) метилбензоат) лиганд. .Мы также сравниваем оба типа фосфоресцентных мицелл ( [email protected] ₁₅ — b -PEG ₁₁₀ и [email protected] ₄₅ — b -PEG ₁₁₀ ) с агрегатом- свободные нековалентные аддукты Ir1 с человеческим сывороточным альбумином ( [email protected] ). Наконец, мы оцениваем применимость всех этих фосфоресцентных наночастиц для восприятия кислорода с помощью визуализации времени жизни фосфоресценции (PLIM). Обе изученные мицеллы блок-сополимера компактны (гидродинамические радиусы менее 20 нм) и солюбилизируют Ir1 до не менее 8 мас.% с почти 100% эффективностью загрузки при сохранении сложной фосфоресценции. Напротив, эффективность загрузки Ir1 в [email protected] не превышает 27%, что приводит к максимально возможной загрузке 0,35 мас.% И гораздо более низкой интенсивности люминесценции. Измерения в течение срока службы показали, что [защита электронной почты] ₄₅ — b -PEG ₁₁₀ мицеллы являются лучшими в защите Ir1 от взаимодействия с компонентами физиологической среды, в то время как [защита электронной почты] ₁₅ — b -PEG ₁₁₀ демонстрирует самую высокую реакцию времени жизни на изменения кислорода (τ _deg / τ _aer = 2.5), самая быстрая интернализация в монослои клеток яичника китайского хомячка (CHO-K1) и самый сильный внутриклеточный сигнал PLIM. Хотя ни одна из систем не продемонстрировала идеального сочетания желаемых свойств, настоящее исследование ясно демонстрирует высокий потенциал мицелл фосфоресцирующего блок-сополимера в восприятии кислорода PLIM.

Европа PMC

, ^1, ², ¹, ¹, ^1, ³ и ¹

Sergi Garcia-Barreda

^{1 Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentario de Aragón — IA2 (CITA – Universidad de Zaragoza), Avda.Montañana 930, 50059 Сарагоса, Испания}

² Centro de Investigación y Experimentación en Truficultura de la Diputación de Huesca (CIET), Polígono Fabardo s / n, 22430 Граус, Испания

Педро Марко 1

2 Педро Марко 91 Forestales, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentario de Aragón — IA2 (CITA – Universidad de Zaragoza), Avda. Montañana 930, 50059 Сарагоса, Испания

Мария Мартин-Сантафе

¹ Unidad de Recursos Forestales, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentarago de AragónA .Montañana 930, 50059 Сарагоса, Испания

Eva Tejedor-Calvo

¹ Unidad de Recursos Forestales, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentaria de Aragón (CITA), IA Agroalimentario de Aragón . Montañana 930, 50059 Сарагоса, Испания

³ Департамент производства и определения характеристик новых пищевых продуктов, Институт пищевых исследований — CIAL (UAM – CSIC), C / Nicolas Cabrera 9, Campus de Cantoblanco, Автономный университет Мадрида, 28049 Мадрид, Испания

Серхио Санчес

¹ Unidad de Recursos Forestales, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentario de Aragónda — IA2 (CITA – Universidad de Zara.Montañana 930, 50059 Сарагоса, Испания

¹ Unidad de Recursos Forestales, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Instituto Agroalimentario de Aragón — IA2 (CITA – Universidad de Zaragoza). Montañana 930, 50059 Сарагоса, Испания

² Centro de Investigación y Experimentación en Truficultura de la Diputación de Huesca (CIET), Polígono Fabardo s / n, 22430 Graus, Spain

³ Foods, Институт пищевых исследований — CIAL (UAM – CSIC), C / Nicolas Cabrera 9, Campus de Cantoblanco, Автономный университет Мадрида, 28049 Мадрид, Испания

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 28.10.2019 г .; Принято 2020 24 февраля.

Открытый доступ Эта статья находится под международной лицензией Creative Commons Attribution 4.0, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или любом формате при условии, что вы надлежащим образом укажете оригинал Автор (ы) и источник предоставляют ссылку на лицензию Creative Commons и указывают, были ли внесены изменения. Изображения или другие материалы третьих лиц в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной линии для материала.Если материал не включен в лицензию Creative Commons для статьи и ваше предполагаемое использование не разрешено законом или превышает разрешенное использование, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Сопутствующие данные

Дополнительные материалы: Дополнительная информация.

Заявление о доступности данных: Наборы данных, сгенерированные и проанализированные в ходе текущего исследования, не являются общедоступными из-за соглашения о конфиденциальности с владельцем фруктового сада (информация считается конфиденциальной с точки зрения конкуренции с точки зрения производителя), но доступны по адресу соответствующий автор по обоснованной просьбе.

Реферат

При культивировании Tuber melanosporum признаки плодовых тел приобретают все большее значение в связи с их растущим влиянием на цены. Мы исследовали почвенные и временные паттерны признаков плодового тела и охарактеризовали влияние трюфельных гнезд (локализованная добавка на основе торфа, дополненная спорами T. melanosporum ) на признаки. Мы отслеживали признаки плодового тела в течение двух сезонов плодоношения в трех кварталах по градиенту почвы. Каждая черта следовала определенным эдафическим и временным паттернам.Количество плодовых тел на один раскоп и зрелость спор следовали характерным внутрисезонным тенденциям, тогда как масса плодовых тел и зараженность трюфельными жуками зависели от сложных взаимодействий между почвенными и временными переменными, что свидетельствует о соответствующем влиянии годовых условий окружающей среды. Применение трюфельных гнезд увеличило глубину плодового тела, улучшило его форму и уменьшило заражение трюфельными жуками. В гнездах увеличивалось количество плодовых тел на один раскоп, но только в двух почвах, что указывает на важную роль поверхности раздела почва / субстрат в начале плодоношения.Эти результаты описывают сложный сценарий, в котором факторы окружающей среды по-разному влияют на каждую черту. В этом сценарии оказалось, что гнезда эффективно изменяют несколько признаков, хотя и не всегда в желаемом направлении.

Тематические термины: Агроэкология, Прикладная микробиология, Экология грибов

Введение

Европейский черный трюфель ( Tuber melanosporum ) — эктомикоризный гриб, высоко ценимый в «высокой кухне» за его органолептические свойства.Он произрастает в дикой природе в открытых дубовых лесах на юге Европы, хотя в настоящее время большая часть продукции T. melanosporum собирается в садах, засаженных саженцами, ранее инокулированными в контролируемых условиях. Выращивание трюфелей значительно расширилось за последние десятилетия и распространилось по всему миру ^¹. Это ведет к увеличению и более стабильному предложению трюфелей на рынки в последние годы, что способствует дифференциации цен по качеству ^².Стандарты товарного качества определяются как признаками доуборочного плодового тела (FB), так и послеуборочной практикой ^³. Наиболее важными среди первых являются спелость FB, цвет глебы (связанный со зрелостью спор), абиотические и биотические повреждения, свежий вес и форма ^⁴.

Несмотря на недавние достижения, выращивание трюфелей еще не полностью приручено, поскольку остаются неопределенности в отношении процесса спаривания и процесса формирования FB ^{⁵, ⁶}.Механизмы окружающей среды, запускающие плодоношение и влияющие на развитие и созревание FB, все еще плохо изучены ^{⁶, ⁷}. Эдафические и климатические факторы играют ключевую роль в урожайности, фенологии и морфологии эктомикоризных ФБ ^{⁸ — ¹⁰}. Это особенно вероятно применимо к трюфелям, которые растут под землей, и для их развития и созревания требуется несколько месяцев. ^{¹¹, ¹²}. Информация о влиянии факторов среды на признаки ФБ может помочь уточнить экологию T.melanosporum и может быть полезен для повышения продуктивности и устойчивости выращивания трюфелей.

Выявление связи между признаками FB и почвоклиматическими условиями затруднено, потому что: (1) длительный период образования FB трюфелей препятствует идентификации причинно-следственных связей, (2) признаки FB могут быть опосредованы различными способами, такими как физиология грибов, хозяин физиология или пространственно-временное распределение ресурсов ^⁹ и (3) некоторые черты могут быть связаны друг с другом и уравновешиваться друг с другом.Репродуктивное вложение черного трюфеля (определяемое количеством и размером FB), вероятно, зависит от доступности ресурсов, среди которых основные ресурсы, предоставляемые хозяином ^¹³. Вода, температура и их влияние на почву Диффузия O ₂ и CO ₂ также являются ключевыми факторами для образования ФБ у микоризных грибов ^⁹. С другой стороны, зрелость и спелость играют экологически значимую роль в распространении трюфелей, для чего требуются полностью функциональные споры, а также испускание летучих сигналов, привлекающих переносчиков расселения животных.Однако взаимосвязь между зрелостью спор и развитием аромата еще недостаточно изучена ^¹⁴. Привлекаемые летучими трюфелями, трюфельные жуки (род Leiodes ) являются одними из наиболее частых потребителей трюфельных FB в испанских садах T. melanosporum , достигая в некоторых случаях высоких уровней заражения FB ^¹⁵. Жуки-трюфели сохраняются в виде диапаузирующих личинок в почве фруктовых садов с мая по сентябрь, при этом взрослые особи появляются для совокупления и откладывают яйца около трюфельного хозяйства с середины сентября по апрель ^¹⁶.С момента выхода взрослых особей из почвы до появления личинок микофагов может потребоваться от одного до 1,5 месяцев. ^¹⁵.

Неопределенности и пробелы в понимании образования FB могут поставить под вопрос продуктивность и устойчивость выращивания трюфелей. Во многих регионах, особенно в тех, где большинство садов молодые, управление трюфельными садами все еще адаптируется к местным условиям. Некоторые из применяемых в настоящее время культурных практик были заимствованы без изменений из других регионов, тогда как другие практики были эмпирически разработаны производителями.Один из этих приемов, так называемые «трюфельные гнезда», «трюфельные колодцы» или «трюфельные ловушки» (далее именуемые «гнезда»), широко распространились среди испанских производителей в последнее десятилетие. В настоящее время существует более десяти коммерческих субстратов и даже тракторные орудия, специально предназначенные для создания таких гнезд. Этот метод является адаптацией старой практики, используемой сборщиками диких трюфелей, которая заключалась в точечном внесении разложившихся органических веществ или угольных почв для улучшения почвы, окружающей трюфель ^{¹⁷, ¹⁸}.Одним из инновационных аспектов применения гнезд в трюфельных садах является использование субстратов на основе торфа, которые во многом отличаются от минеральных почв: низкая насыпная плотность, высокая пористость, высокая аэрация и хорошая дренируемость, высокая влагоудерживающая способность и легкодоступность воды. , низкая теплопроводность при равном содержании воды и низком содержании питательных веществ ^{¹⁹ — ²¹}. Гнезда обычно дополняются спорами трюфелей, которые могут играть роль в воспроизводстве, если, как предполагают Le Tacon et al .(2016) ^⁵, они могут действовать как мужские элементы при половом спаривании. Однако, несмотря на широкое использование гнезд в Испании, их влияние на признаки FB еще не изучено.

В этом исследовании мы стремимся изучить почвенные и временные закономерности агрономически важных признаков T. melanosporum FB, таких как вес, зрелость, форма и вероятность заражения Leiodes . Мы также стремимся охарактеризовать влияние гнезд на признаки FB.Производители трюфелей утверждают, что гнезда повышают качество трюфелей, хотя некоторые производители предупреждают о проблемах, связанных с проблемой повторного увлажнения торфа после сушки ^²², в то время как другие считают, что растущие в гнездах трюфельные FB имеют более низкую зрелость (менее меланизированные споры, более светлые глебы) и спелость (меньшая интенсивность аромата).

Результаты

В течение сезонов плодоношения 2016–2017 и 2017–2018 годов было собрано 1865 T. melanosporum FBs было собрано в 1212 раскопках, при этом гнезда составили 53% собранных FB и 42% выкопанных раскопок (Таблица).Были обнаружены только четыре FB от других видов Tuber ( Tuber aestivum ).

Таблица 1

Количество плодовых тел T. melanosporum собранных плодовых тел и раскопок.

Блок 38 137127 2018

	Плодовые тела		Раскопки
	Насыпной грунт	Гнезда	Насыпной грунт	Гнезда
Сезон 2016–2012
112	92
Блок почвы 2	163	143	129	83
Блок почвы 3	79	50	71	71	71
Блок почвы 1	178	225	125	94
Блок почвы 2	166	146	134	30	134	30 905	190	126	111

Доля раскопок, выкопанных в гнездах v в течение сезона плодоношения (значение P, скорректированное с поправкой Холма-Бонферрони для множественных испытаний, P _Holm <0.001, дополнительная таблица ^S1), демонстрируя положительную тенденцию с ее начала до начала декабря (день сезона: 25), после чего относительная численность раскопок в гнездах начала снижаться (рис.). Раскопки, выкопанные в гнездах, оставались доминирующими с середины ноября до середины января (дни с 0 по 60), снижаясь до самых низких значений с середины февраля (день 90), когда в основном преобладали раскопки, выкопанные в насыпной почве. GAM не показал различий между сезонами ( P _Holm = 0.36) или среди блоков грунта ( P _Holm = 0,39, Дополнительная таблица ^S1).

Глубина раскопок колебалась от 0–10 до 30–40 см. Трюфели, собранные в гнездах, были глубже, чем трюфели, собранные в насыпной почве ( P _Holm <0,001, дополнительная таблица ^S2, рис.). В 57% раскопок, выкопанных в насыпном грунте, БП были обнаружены на глубине менее 10 см, тогда как в 67% раскопок гнезд БП были обнаружены на глубине от 10 до 20 см.Глубина не показала какой-либо временной тенденции в течение сезона плодоношения ( P _Holm = 0,71) и не зависела от сезона или почвенного блока ( P _Holm = 0,50 и P _Holm = 0,93 соответственно, дополнительная таблица ^S2).

Около 74% раскопок представляли только один FB, а в остальных раскопках было от двух до 17. Количество FB на раскоп менялось в течение сезона плодоношения ( P _Holm <0.001, дополнительная таблица ^S3), с положительным временным трендом с начала сезона до начала января (день сезона: 55), затем с уменьшением до конца сезона. Максимальное количество FB за один раскоп было достигнуто с середины декабря до конца января (с 30 по 75 дни), тогда как минимальные значения приходились на конец февраля (день 100, рис.). На количество ОС на раскоп также влияло взаимодействие факторов гнездо и почвенный блок ( P _Holm = 0.036, Дополнительная таблица ^S3). Гнезда показали положительный эффект в почвенном блоке 1, в котором количество FB на один раскоп почти удвоилось по сравнению с насыпной почвой; положительный эффект в почвенном блоке 2, но только увеличение количества ФБ на 30%; и никакого эффекта в почвенном блоке 3 (рис.). Не было обнаружено различий между объемным грунтом трех почвенных блоков (рис.). Различий между сезонами не обнаружено ( P _Holm = 0,47).

Вес собранных FB варьировался от 0.От 2 до 330 г. На вес плодового тела в раскопках с одним плодовым телом (раскопки, в которых был обнаружен только один FB) влияло взаимодействие между факторами сезона, почвенного блока и гнезда ( P _Holm = 0,004, дополнительная таблица ^S4). Не было обнаружено различий между гнездами и соответствующей насыпной почвой для любой комбинации почвенного блока и сезона, за исключением увеличения веса гнезд из почвенного блока 1 в течение сезона 2017–2018 гг. (Рис.). В сезоне 2016–2017 гг. Масса ПБ была выше в насыпном грунте Почвенного блока 1, чем в насыпном грунте Почвенного блока 3, с Почвенным блоком 2 в промежуточной ситуации (рис.). В сезоне 2017–2018 гг. Таких различий не обнаружено. В гнездах различий между почвенными блоками в сезоне 2016–2017 гг. Не обнаружено, то же самое произошло в 2017–2018 гг. Однако в сезоне 2016–2017 гг. Масса ОС в гнездах почвенного блока 1 была ниже, чем в 2017–2018 гг. (Рис.). GAM не показал какой-либо временной тенденции в течение сезона ( P _Holm = 1, дополнительная таблица ^S4).

Индекс зрелости спор в измеренных ФБ находился в диапазоне от 0 до 0.98. Созревание спор при раскопках с одним плодом показало положительную тенденцию в течение всего сезона плодоношения ( P _Holm <0,001, дополнительная таблица ^S5, рис.). Индекс быстро рос с начала ноября до середины декабря (дни сезона от -10 до 30), а затем медленнее. GAM не показал различий между сезонами ( P _Holm = 0,21), между почвенными блоками ( P _Holm = 0,79) или связанными с гнездами ( P _Holm = 0.96, Дополнительная таблица ^S5).

Показатель формы ПП при раскопках с одним плодовым телом был выше в гнездах, чем в насыпной почве ( P _Holm <0,001, дополнительная таблица ^S6, рис.). Блок почвы 3 показал более высокий индекс формы, чем блок почвы 2, с блоком почвы 1 в промежуточной ситуации ( P _Holm <0,001, дополнительная таблица ^S6, рис.). В сезоне 2016–2017 трюфели показали более высокий индекс формы, чем в сезоне 2017–2018 ( P _Holm = 0.008, дополнительная таблица ^S6, рис.). GAM не показал какой-либо временной тенденции в течение сезона ( P _Holm = 1, дополнительная таблица ^S6).

Плотность измеренных FB варьировалась от 0,8 до 1,9 г / мл ^-1 в FB с массой более 10 г, с несколькими крайними значениями в меньших FB (0,6–2,9 г / мл ^-1). Плотность плодового тела при раскопках с одним плодовым телом зависела от взаимодействия между сезоном, гнездом и временем ( P _Holm <0.001, Дополнительная таблица ^S7). В сезоне 2016–2017 гг. Плотность в основной массе почвы не показывала какой-либо временной тенденции, тогда как в гнездах она показывала отрицательную тенденцию с выраженными колебаниями (дополнительный рис. ^S1). В сезоне 2017–2018 гг. Не было обнаружено различий между насыпной почвой и гнездами в любой момент сезона, при этом оба варианта показали отрицательный временной тренд. В отличие от насыпной почвы, в гнездах изменчивость плотности была особенно высокой в начале сезона (дополнительный рис.^S1).

Типичные кормовые галереи и поверхностный просмотр личинок Leiodes и взрослых особей были обнаружены в 23,1% собранных FB, тогда как другие абиотические и биотические повреждения показали гораздо меньшую частоту: гниение (в 3,1% FB), трюфельные мухи из рода Suillia (2,9%), растрескивание поверхности (1,6%) и замерзание (0,5%). Доля ФБ, зараженных Leiodes , была ниже в гнездах, чем в насыпной почве ( P _Holm = 0.044, дополнительная таблица ^S8, рис.). Заражение Leiodes также зависело от взаимодействия между сезоном, почвенным блоком и временем ( P _Holm <0,001, дополнительная таблица ^S8). Блоки почвы 1 и 2 показали в оба сезона более высокую заболеваемость Leiodes в начале сезона, чем в конце сезона (рис.). GAM показал, что эти временные тренды были более выражены в сезоне 2017–2018 гг., Чем в 2016–2017 гг., При этом в блоке 3 почвы не было обнаружено какого-либо временного тренда в последнем.В сезоне 2017–2018 гг. Почвенный блок 1 показал контрастные различия с другими блоками в течение части сезона, особенно с середины января (день сезона 55, рис.).

Обсуждение

Это исследование является первым, которое предоставило информацию о почвенных и временных паттернах, связанных с признаками T. melanosporum FB. Наши результаты показали, что на каждую из исследованных черт по-разному влияли факторы окружающей среды. Кроме того, вес FB и зараженность Leiodes зависели от взаимодействия этих факторов.

Количество FB за один раскоп менялось в течение сезона плодоношения. Если, как предполагают Pacioni et al . (2014) ^⁶, оптимальное время начала плодоношения характеризуется температурно-влажностным окном возможностей, наши результаты могут быть связаны с тенденциями в почвенных условиях весной, когда начало плодоношения обычно запускается. Однако наши результаты также можно объяснить временными изменениями смертности от ФБ. Интересно, что количество FB за один раскоп не показало различий между сезонами или между основной массой почвы трех почвенных блоков.

Вес плодового тела показал более сложную картину. На вес БП, вынутых в насыпной грунт в сезоне 2016–2017 гг., Повлияли свойства почвы, при этом более песчаные почвы имеют тенденцию иметь больший вес. Однако, учитывая, что в 2017–2018 годах различий между почвами не было обнаружено, этот эффект, по-видимому, сильно зависит от годовых условий окружающей среды, либо через их влияние на микроклимат почвы, либо на физиологию хозяина. Мы предполагаем, что межгодовые различия могут быть связаны с почвенными условиями или состоянием деревьев в период с июля по октябрь, стадия роста FB, во время которой происходит более интенсивное развитие и рост ^{¹¹, ²³, ²⁴}.Однако межгодовые различия в температуре июля – октября и количестве осадков на нашем участке исследования были незначительными и ограничивались началом сентября (дополнительные таблицы ^S9 и ^S10, дополнительный рисунок ^S2). Напротив, в течение каждого сезона не было обнаружено различий между гнездами трех блоков, что позволяет предположить, что гнезда уменьшали влияние свойств почвы.

Созревание спор показало четкую внутрисезонную временную тенденцию без видимого влияния остальных предикторов.По данным Зариви и др. . (2015) ^²⁴, меланизация спор происходит только после завершения набухания FB. Наши результаты показывают быстрое увеличение зрелости спор с начала ноября до начала декабря, что согласуется с этой точкой зрения, но в нашем случае зрелость продолжает увеличиваться — гораздо более скромно — в течение всего сезона плодоношения. Эта временная закономерность предполагает, что климатические условия и / или физиология грибов управляют этим процессом, с гораздо меньшей ролью изменчивости микроклимата почвы.Плодовые тела, плодоносящие в конце сезона, перед созреванием проходят гораздо более длительный период низкой температуры почвы, чем плодоносящие в начале сезона.

Прогнозируемые значения зрелости спор достигли лишь около 80% в конце сезона. При этом следует учитывать, что пробы глебы отбирались с внешней стороны. По нашему опыту, в начале сезона споры и глебы часто более темные во внутренней части. Таким образом, наши данные могут недооценивать зрелость спор или переоценивать разницу между ранним и поздним сезоном.Однако это вряд ли повлияет на наши выводы по остальным предикторам.

Заражение плодовых тел Leiodes показало общую временную картину в большинстве комбинаций почва-сезон с максимальными уровнями заражения в начале сезона (хотя эти пики были гораздо менее выражены в сезоне 2016–2017 годов, чем в 2017–2018 годах). Этот паттерн может быть связан с жизненным циклом Leiodes , климатическими подсказками или обилием FB, излучающих подходящие изменчивые сигналы. В испанском саду три пика вылета взрослых особей Leiodes были обнаружены в начале, середине и конце сезона ^¹⁵.Наши данные о заражении показали только один ранний пик, что указывает на важную роль других факторов, помимо численности взрослых особей.

Помимо этой общей закономерности, тенденция заражения Leiodes проявляла отличительные черты в каждом сезоне, с более выраженными внутрисезонными колебаниями в 2017–2018 годах. В обоих сезонах период сентябрь-февраль был относительно засушливым, за исключением очень дождливого ноября 2016 г. (Дополнительная таблица ^S10). Согласно Pérez-Andueza (2015) ^¹⁵, вылет взрослых особей увеличивается после дождя, а высокая влажность почвы увеличивает подвижность насекомых в почве.Арзоне (1970) ^¹⁶ также указал, что падение температуры поздней осенью, когда оно сопровождается дождями, ускоряет окукливание. Наши результаты также показали, что свойства почвы модулируют тенденции заражения Leiodes , при этом более глинистая почва показывает меньшую амплитуду внутрисезонных колебаний. Глинистые почвы обычно имеют более низкую теплопроводность ^²⁰, и температура почвы может играть роль в появлении взрослых особей. Различия между почвами и годами показывают, что микросреда почвы эффективно повлияла на заражение FB Leiodes .

Гнезда — обычное дело в испанских трюфельных садах. Наши результаты впервые демонстрируют, что гнезда эффективно модифицируют несколько агрономически важных признаков FB. Плодовые тела, выращенные в гнездах, имели более сферическую форму и меньшую вероятность заражения Leiodes , что приводило к повышению качества трюфелей. Улучшение формы можно легко объяснить более низким и более равномерным сопротивлением проникновению в подложку. Более низкие уровни заражения вредителями могут быть связаны с легким рыхлым субстратом, препятствующим мобильности взрослых особей или нарушающим сцепление яиц с агрегатами почвы ^¹⁶.Этот результат согласуется с нашим случайным наблюдением во время полевого отбора проб, что в FB, растущих частично в насыпной почве и частично в гнезде, галереи Leiodes в основном располагались на почвенной стороне.

Гнезда явно увеличили глубину FB. Это очень ценится испанскими производителями, которые считают, что эти FB менее подвержены абиотическим и биотическим повреждениям и вряд ли пострадают от нерегулярного или несовершенного созревания. Мы не оценивали частоту замерзания или сухости, но в австралийских садах трюфельная гниль представляет собой особенно тревожную проблему для неглубоких FB ^²⁵.

Гнезда увеличили количество FB за один раскоп в двух почвенных блоках, при этом величина этого эффекта сильно зависит от почвенного блока. Мурат и др. . (2016) ^²⁶ предположили, что это увеличение могло быть связано с обилием спор в гнезде, если бы споры действовали как мужские элементы при половом спаривании. В нашем исследовании обилие спор могло быть (по крайней мере частично) причиной различий между насыпной почвой и гнездами. Однако этот фактор вряд ли может объяснить различную величину эффекта гнезда на каждом почвенном блоке, потому что смесь субстрата и измельченных ФБ готовится единообразно и систематически для всего сада.

В качестве альтернативы, увеличение количества FB в гнездах могло быть связано с повышенной выживаемостью FB. Оливье и др. . (1996) ^²⁷ сообщили, что в июне можно найти более десяти крошечных зачатков на квадратный метр насыпной почвы, но в сезон плодоношения сборщики урожая редко находят такие скопления спелых трюфелей. Принимая во внимание свойства торфа и экологические требования для роста FB, высокая доступность воды и аэрация в гнездах могут иметь решающее значение в этом процессе.

Более высокое количество FB за один раскоп, обнаруженное в гнездах, также может быть связано с усиленным началом плодоношения. Установка гнезда создает резкий разрыв на границе раздела объемный грунт / субстрат. Pacioni и др. . (2014) ^⁶ предположили, что начало плодоношения вызвано изменением почвенной среды, что уже было обнаружено для других грибов ^⁹. В нашем исследовании разная величина эффекта гнезд на каждой почве подтверждает эту гипотезу.Москаль и др. . (2001) ^²⁸ рассмотрели влияние торфяных добавок на почву и пришли к выводу, что увеличение доступной воды было более заметным для песчаных, чем глинистых почв.

Остается неясным вопрос, увеличивают ли гнезда вес ФБ. Только в одном сочетании почва-сезон гнезда повлияли (положительно) на вес ФБ, что свидетельствует о сложных взаимодействиях с окружающей средой. Это может быть связано с микроклиматом гнезд, который не всегда эффективно улучшает рост ФБ, или с опосредованным хозяином эффектом.

Спелость одноплодных раскопок гнездами не изменилась. Это указывает на то, что сообщенные проблемы со зрелостью и спелостью в гнездах, если это правда, ограничиваются раскопками с несколькими плодовыми телами (раскопками, в которых было обнаружено более одного FB). Когда собака отмечает раскоп с множеством плодовых тел, это указывает только на то, что по крайней мере один FB созрел. Учитывая, что в некоторых почвах гнезда увеличивают количество FB за один раскоп, было бы интересно исследовать наличие незрелых трюфелей в раскопках с множеством плодовых тел.

Плотность плодового тела в гнездах в начале ноября была более изменчивой, чем в основной массе почвы. Октябрь намного теплее, чем период с ноября по март (дополнительные таблицы ^S9 — ^S11, дополнительный рисунок ^S2). Таким образом, эта изменчивость может быть связана с содержанием воды в FB и проблемой повторного заболачивания торфа, увеличивающей риск высыхания FB. Таким образом, плотность будет отражать микроклимат, который испытывают ФБ в течение последних недель перед созреванием, что подчеркивает важность орошения почв с поправками на торф.Это подтверждается тем фактом, что в течение сезона 2016–2017 гг. Плотность колебалась в гнездах, а не в основной массе почвы. Было бы целесообразно протестировать другие субстраты или почвенные смеси, которые могли бы уменьшить эти проблемы.

Соотношение раскопок, выкопанных в гнездах, и насыпной почвы менялось в течение сезона плодоношения, что указывает на более тяжелое распределение со временем в гнездах. Гнезда, кажется, особенно способствуют плодоношению в начале сезона. Это может быть связано с тем, что грибок обнаруживает условия, способствующие раннему началу плодоношения, раннему созреванию или увеличению скорости роста.Montant и Kulifaj (1990) ^⁷ обнаружили, что в орошаемых теплицах (с повышенной температурой почвы зимой и весной и повышенной влажностью почвы летом) гораздо больше FB было собрано в начале сезона, при этом типичное растрескивание поверхности почвы связано с ускоренным растрескиванием почвы. рост неглубоких ФБ, появившихся на месяц раньше ^²³. Низкая теплопроводность торфа, по-видимому, указывает на медленное повышение температуры весной и медленное понижение поздней осенью.Однако теплопроводность почвы сильно зависит от влажности ^²⁰, а торф показывает высокую доступность воды при низких потенциалах воды.

Изменение соотношения раскопок в гнездах и насыпной почвы в течение сезона, вероятно, приведет к косвенному отрицательному воздействию гнезд на общее качество трюфелей из фруктового сада из-за временных тенденций в зрелости спор и заражения Leiodes . С другой стороны, гнезда, способствующие плодоношению в начале декабря, могут повысить прибыльность сада из-за пика цен на черный трюфель за несколько недель до Рождества.

В заключение, наши результаты показывают, что почвенные и временные паттерны, которые управляют признаками T. melanosporum FB, специфичны для каждого признака. Количество FB за один раскоп и зрелость спор показали четкие внутрисезонные временные закономерности, которые были неизменными из года в год. Напротив, вес FB и заражение Leiodes подвергались сложным взаимодействиям между почвенными и временными переменными. В этом контексте гнезда эффективно увеличили глубину FB, улучшили форму и снизили зараженность Leiodes , без снижения зрелости FB при раскопках с одним плодовым телом.Наши результаты также дали намек на проблемы, связанные с гидравлическими свойствами торфа. Различная эффективность гнезд в увеличении количества FB среди трех почв предполагает релевантную роль неоднородностей почвы в инициировании FB. Исследование показывает, что гнезда — полезный инструмент для продвижения в изучении репродуктивной биологии и экологии трюфелей.

Материалы и методы

План эксперимента и сбор данных

Исследование проводилось в трюфельном саду в округе Гудар-Хаваламбре (провинция Теруэль, восточная Испания, 1150 м над уровнем моря).с. л.). Климат континентально-средиземноморский, со средним годовым количеством осадков 519 мм и средней годовой температурой 11,1 ° C (дополнительная таблица ^S11). В 2001 году в саду было засажено Quercus ilex subsp. balta и Quercus faginea саженцы, инокулированные T. melanosporum . Саженцы были выращены в коммерческом питомнике и контролировались государственными органами в соответствии с методом INIA-Aragón ^²⁹.Они были посажены с плотностью 278 гектаров ^-1 (6 × 6 м), и два вида-хозяина были расположены рядами с соотношением 2: 1 на всем экспериментальном участке. Во время предпродуктивной фазы сада почва обрабатывалась один раз в год, а с четвертого года деревья ежегодно подрезались.

С того момента, как в саду начали выращивать трюфели, в возрасте 6–10 лет во всех комбинациях типологии дерева-хозяина и почвы (дополнительная таблица ^S12) ежегодно проводится ряд культурных практик сразу после окончания плодоношения. сезон: обрезка деревьев, обработка почвы и установка гнезд.Почва между рядами деревьев мелко обрабатывается зубчатыми боронами (оставляя только 1–1,5 м вокруг каждого дерева). Ежегодно вокруг каждого дерева обоих видов-хозяев устраивают около десяти гнезд. Установка гнезда включает вырытие тронконической ямы глубиной около 25 см, заполнение ее примерно 1,5 л субстрата на основе торфа European Sphagnum (Turbatruf ® от Projar: смесь черного торфа — белого торфа — кокосового волокна — перлита 11–5 –3–1, с повышением pH до 7,5) и повторно засыпая субстрат почвой.FB из измельченных спелых трюфелей смешивают с субстратом (0,1 г сухих плодовых тел на литр субстрата), и смесь тщательно гомогенизируют перед внесением в почву. Гнезда систематически располагаются через равные промежутки времени по окружности дерева по центру. Каждый год новую окружность устанавливают немного дальше, избегая радиального выравнивания гнезд с гнездами предыдущих лет. В результате на расстоянии до 2 м от ствола образовался узор quincunx. С апреля по октябрь сад орошается системой дождевания в засушливые периоды с небольшим количеством осадков в соответствии с критерием водного потенциала Le Tacon et al .(1982) ^³⁰. В сезон 2017–2018 годов сад также орошался с ноября по январь из-за небольшого количества зимних осадков. Сбор трюфелей производится владельцем один раз в неделю в течение всего сезона плодоношения, с ноября по март.

Почвы с разными свойствами можно найти на 15 га сада. Три блока площадью 0,25 га были выбраны на линии трансекты длиной 300 м, с супесями. Почвенный блок 1, развивающийся на третичных алевролитах / песчаниках, суглинок / суглинок. Почвенный блок 3 на глинистых известняках и суглинках мелового периода. оба материала (дополнительная таблица ^S12).

В сезон плодоношения 2016–2017 и 2017–2018 годов каждый квартал неоднократно посещался (сезон 2016–2017: 18.11.2016, 12.12.2016, 01.10.2017, 02.07.2017, 20.02. / 2017, 03.07.2017 и 22.03.2017; сезон 2017–2018: 2.11.2017, 16.11.2017, 5.12.2017, 20.12.2017, 01.10.2018, 31.01.2018 и 03.07.2018). При каждом посещении трюфельные FB собирали с помощью обученных собак и измеряли. В те недели, когда мы не посещали сад, хозяин собирал трюфели, как обычно, один раз в неделю.

Каждый раз, когда собака определяла место, где можно было найти трюфели, земля выкапывалась, и мы фиксировали, росли ли трюфели в насыпной земле или в субстрате для гнезд.Трюфели были классифицированы как развитые в гнезде, когда торф сохранял свою характерную физическую структуру (без явных признаков разложения), а гнездо оставалось невредимым (без признаков того, что оно было разобрано или смешано с почвой). В подавляющем большинстве случаев это происходило на 2–4-летних гнездах (оценивается по расстоянию до ствола и общему виду торфа, данные не показаны), что типично для испанских садов и согласуется с наблюдениями во Франции ^²⁶.Мы также записали количество FB за один раскоп (каждый раскоп соответствует метке собаки, при этом все FB растут вместе или в непосредственной близости), глубину (нижней части самого глубокого трюфеля, с интервалом 10 см) и зараженность Leiodes. жуков (идентификация отличительных галерей или просмотр перидиума FB после аккуратной чистки щеткой).

Чтобы не смешивать влияние субстрата на признаки FB с эффектом нескольких трюфелей, растущих бок о бок, следующие признаки были измерены только при раскопках с одним плодовым телом: свежий вес (измеренный с точностью до 0.1 г после аккуратного удаления почвы и субстрата кистью), формы, плотности и зрелости спор. Индекс формы рассчитывался как комбинация (i) сферичности (соотношение между измеренным максимальным и минимальным диаметром), (ii) лобулярности (процентной доли поверхности FB, занятой дольками), визуальной оценки и (iii) средней высоты долек. относительно размера FB, оценивается визуально. Для каждого компонента была определена категориальная классификация, в результате чего был получен индекс формы с девятью категориями (дополнительная таблица ^S13, дополнительный рис.^S3). Плотность плодового тела рассчитывалась как отношение между сырой массой и объемом (измеренным путем вытеснения воды с точностью до 1 мл). Индекс зрелости спор рассчитывали как процент асков, содержащих зрелые (т.е. темно-коричневые и колючие) споры, согласно Zeppa et al . (2002) ^³¹. Пробы глебы, достигающие 5–10 мм под перидием, были взяты с помощью скальпеля, чтобы владелец сада мог продать FB без снижения цены. Для расчета индекса зрелости в каждой выборке глеба было подсчитано не менее 50 случайно выбранных аски.

Статистический анализ

Обобщенные аддитивные модели (GAM) использовались для анализа влияния гнезд на признаки FB, временного изменения этих признаков (в пределах сезона и между годами), различий в признаках FB, связанных с изменчивостью почвы и взаимодействия между всеми этими переменными-предикторами. GAM допускают нелинейные (гладкие) эффекты переменных-предикторов и различные типы распределения ошибок в ответе ^³². Временной тренд в течение сезона плодоношения (день сезона) рассматривался как сглаженная предикторная переменная, тогда как остальные предикторы (сезон, почвенный блок, гнездо) были включены как факторы (несглаженные).Биномиальное распределение ошибок использовалось для доли FB, выкопанных в гнездах, и доли FB, зараженных Leiodes . Для глубины и формы СП использовалось распределение ошибок Пуассона. Отрицательное биномиальное распределение ошибок использовалось для количества FB на каждую раскопку, чтобы исправить избыточную дисперсию в распределениях Пуассона и квазипуассона. Для веса, плотности и зрелости спор использовали гауссово (нормальное) распределение ошибок. Сглаженные условия задавались с помощью сглаживающих устройств усадки (сплайн кубической регрессии).Взаимодействие сглаженного члена с факторами было подогнано, позволяя получить отдельный сглаживающий элемент для каждого уровня фактора.

Для каждого признака FB были подобраны три GAM и выбран один с самым низким информационным критерием Акаике (AIC): (i) модель, содержащая только основные эффекты, (ii) модель, содержащая все основные эффекты и двусторонние взаимодействия. и (iii) модель, содержащая все основные эффекты, двусторонние и трехсторонние взаимодействия между переменными гнездом, днем сезона, сезоном и почвенным блоком.Эти модели включают все возможные взаимодействия, потому что не было предыдущих исследований, отклоняющих какие-либо из них, и их исключение может изменить результаты статистического анализа. Базовый размер гладких поверхностей был проверен и при необходимости увеличен. Соответствие выбранной структуры ошибок оценивалось с помощью избыточной дисперсии. Вес и плотность плодового тела были преобразованы логарифмически, чтобы более точно соответствовать предположениям о нормальном распределении и постоянной дисперсии, которые оценивались в каждой модели нормального распределения ошибок.Все анализы проводились с пакетом mgcv в R ^³³, корректируя P-значения с поправкой Холма-Бонферрони для множественных испытаний.

Дополнительная информация

Благодарности

Мы благодарим владельца трюфельного сада за возможность собрать трюфели, предоставить данные о фруктовом саду и разрешить публикацию результатов. Эта работа финансировалась соглашением о сотрудничестве 2016/1/0010 с Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA).С.Г.-Б. участие было поддержано соглашением о сотрудничестве для работы CIET (финансируется Diputación de Huesca, при участии CITA, Comarca de la Ribagorza и Ayuntamiento de Graus). ТАК ДАЛЕЕ. участие поддержано проектом INIA RTA2015-00053-00-00. Метеорологическая информация за 2016-2018 годы была предоставлена Confederación Hidrográfica del Júcar (Ministerio para la Transición Ecológica, Gobierno de España).

Вклад авторов

S.С., С.Г.-Б. и П. разработал исследование. Все авторы провели полевые исследования. С.Г.-Б. и С.С. проанализировали и интерпретировали данные и руководили написанием рукописи. Все авторы внесли свой вклад в написание рукописи.

Доступность данных

Наборы данных, сгенерированные и проанализированные в ходе текущего исследования, не являются общедоступными из-за соглашения о конфиденциальности с владельцем сада (информация считается конфиденциальной с точки зрения конкуренции с точки зрения производителя), но доступны от соответствующего автора в разумные сроки. запрос.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Сноски

Примечание издателя Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и о принадлежности организаций.

Дополнительная информация

доступна для этой статьи по адресу 10.1038 / s41598-020-61274-x.

Список литературы

1. Рейна С., Гарсия-Барреда С. Выращивание черных трюфелей: глобальная реальность. Для. Syst.2014; 23: 317–328. [Google Scholar] 2. Гарсия-Барреда С. и др. Сбор черного трюфеля в испанских лесах: тенденции, текущая политика и практика, а также влияние на его устойчивость. Environ. Управлять. 2018; 61: 535–544. DOI: 10.1007 / s00267-017-0973-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Кампо Е., Марко П., Ория Р., Бланко Д., Вентурини М.Э. Как лучше всего сохранить настоящий аромат черного трюфеля (Tuber melanosporum)? Ольфактометрический и сенсорный подход. LWT — Food Sci. Technol. 2017; 80: 84–91.DOI: 10.1016 / j.lwt.2017.02.009. [CrossRef] [Google Scholar]

4. ЕЭК ООН. Стандарт ЕЭК ООН FFV-53 , касающийся сбыта и контроля товарного качества трюфелей : издание 2017 (2017).

5. Le Tacon F, et al. Определения и неопределенности относительно жизненного цикла черного трюфеля Перигор (Tuber melanosporum Vittad.) Ann. Для. Sci. 2016; 73: 105–117. DOI: 10.1007 / s13595-015-0461-1. [CrossRef] [Google Scholar] 6. Pacioni G, et al. Инструментальный мониторинг рождения и развития трюфелей в саду Tuber melanosporum.Микориза. 2014; 24: 65–72. DOI: 10.1007 / s00572-014-0561-z. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Montant C, Kulifaj M. L’ascocarpe du Tuber melanosporum Vitt. Contrôle des facteurs externes agissant Sur sa формирование, круассанс и созревание. C. R. Acad. Sci. III. 1990; 311: 123–126. [Google Scholar] 8. Kauserud H, et al. Размер спор грибов и время плодоношения тесно связаны: важна ли влажность? Биол. Lett. 2011; 7: 273–276. DOI: 10.1098 / rsbl.2010.0820. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9.Бодди Л. и др. Изменение климата влияет на плодоношение грибов. Fungal Ecol. 2014; 10: 20–33. DOI: 10.1016 / j.funeco.2013.10.006. [CrossRef] [Google Scholar] 10. Агреда Т., Агеда Б., Олано Дж. М., Висенте-Серрано С. М., Фернандес-Тойран М. Повышенный спрос на эвапотранспирацию в средиземноморском климате может вызвать снижение урожайности грибов в условиях глобального потепления. Glob. Чанг. Биол. 2015; 21: 3499–3510. DOI: 10.1111 / gcb.12960. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Montant C, Kulifaj M, Gleize R. Note sur la recolte de jeunes ascocarpes du Tuber melanosporum Vitt.(Truffe noire de perigord) и эволюция. C. R. Acad. Sci. III. 1983; 296: 463–468. [Google Scholar] 12. Гарсиа-Барреда С., Санчес С., Марко П., Серрано-Нотиволи Р. Агроклиматическое районирование испанских лесов с естественным производством черного трюфеля. Agric. Для. Meteorol. 2019; 269–270: 231–238. DOI: 10.1016 / j.agrformet.2019.02.020. [CrossRef] [Google Scholar] 13. Ле Такон Ф и др. Перенос углерода от хозяина к Tuber melanosporum Mycorrhizas и Ascocarps с последующим использованием метода импульсного мечения 13C. Plos One.2013; 8: e64626. DOI: 10.1371 / journal.pone.0064626. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Molinier V, Murat C, Frochot H, Wipf D, Splivallo R. Анализ мелкомасштабной пространственной генетической структуры черного трюфеля Tuber aestivum и его связь с изменчивостью аромата. Environ. Microbiol. 2015; 17: 3039–3050. DOI: 10.1111 / 1462-2920.12910. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

15. Перес-Андуэса, Г. Энтомофауна, асочада а ля труфа негра ( Tuber melanosporum, Vittadini) cultivada en España Central: incidencia y valoración de las Principalales especies micófagas; Diptera, Heleomyzidae).(Университет Саламанки, 2015 г.).

16. Arzone A. Reperti ecologici ed etologici di Liodes cinnamomea Panzer vivente su Tuber melanosporum Vittadini (Coleoptera Staphylinoidea) Ann. della Fac. ди Sciènze Agrar. della Univ. degli Stud. ди Турин. 1970; 5: 317–357. [Google Scholar]

17. Рейна, С. и Колинас, К. Truficultura. В Truficultura: Fundamentos y tecnicas (ред. Рейна, С.) 235–274 (Ed. Mundi-Prensa, 2012).

18. Гарсия-Барреда С., Молина-Грау С., Форкаделл Р., Санчес С., Рейна С.Долгосрочное изменение почвы в исторических очагах древесного угля влияет на микоризное развитие Tuber melanosporum и условия окружающей среды для плодоношения. Микориза. 2017; 27: 603–609. DOI: 10.1007 / s00572-017-0773-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Арго WR. Физические свойства корневой среды. Хорттехнология. 1998. 8: 481–485. DOI: 10.21273 / HORTTECH.8.4.481. [CrossRef] [Google Scholar] 20. Abu-Hambeh NH, Reeder RC. Теплопроводность почвы: влияние плотности, влажности, концентрации солей и органических веществ.Почвоведение. Soc. Являюсь. J. 2000; 64: 1285–1290. DOI: 10.2136 / sssaj2000.6441285x. [CrossRef] [Google Scholar]

21. Мишель, Ж.-К. Физические свойства торфа: ключевой фактор для современной среды выращивания. Торф болотный 6 , статья 2 (2010).

22. Michel J-C, et al. Водоотталкивающие свойства органических питательных сред и их влияние на их гидравлические свойства. Acta Hortic. 2008; 779: 121–130. DOI: 10.17660 / ActaHortic.2008.779.13. [CrossRef] [Google Scholar]

23. Сурзат П., Кулифай М.& Montant, C. Résultats methods sur la trufficulture à parti d’expérimentations pipelineites dans le Lot entre 1985 et 1992 . (Station d’Expérimentations sur la Truffe, 1993).

24. Zarivi O, et al. Проверка эталонных генов для количественной ПЦР в реальном времени на стадиях развития черного трюфеля Перигор (Tuber melanosporum). Фитохимия. 2015; 116: 78–86. DOI: 10.1016 / j.phytochem.2015.02.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

25. Эслик, Х. и Делл, Б. Роль орошения в гниении трюфелей в Западной Австралии.In Тезисы 1-го Международного конгресса по огородничеству Teruel Tuber 2013 37 (Gobierno de Aragón — CITA, 2013).

26. Murat C, et al. Улавливание трюфелей в отверстия: многообещающий метод улучшения производства и определения жизненного цикла трюфелей. Ital. J. Mycol. 2016; 45: 47–53. [Google Scholar]

27. Olivier, J.-M., Savignac, J.-C. & Sourzat, P. Truffe et trufficulture . (Под ред. Fanlac, 1996).

28. Москаль Т.Д., Лескив Л., Наэт М.А., Чанасык Д.С.Влияние органического углерода (торфа) на удержание влаги в торфо-минеральных смесях. Жестяная банка. J. Почвоведение. 2001. 81: 205–211. DOI: 10.4141 / S00-011. [CrossRef] [Google Scholar] 29. Андрес-Альпуэнте А., Санчес С., Мартин М., Агирре А. Дж., Барриузо Дж. Дж. Сравнительный анализ различных методов оценки качества проростков Quercus ilex, инокулированных Tuber melanosporum. Микориза. 2014; 24: S29 – S37. DOI: 10.1007 / s00572-014-0563-х. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Ле Такон Ф, Дельмас Дж., Глейз Р., Бушар Д.Влияние режима увлажнения солей и удобрений на плодоношение черного трюфа Перигора (Tuber melanosporum Vitt.) В южном регионе Франции. Acta Oecologica, Oecologia Appl. 1982; 3: 291–306. [Google Scholar] 31. Zeppa S, et al. Идентификация предполагаемых генов, участвующих в развитии плодового тела Tuber borchii, путем дифференциального отображения мРНК в агарозном геле. Curr. Genet. 2002; 42: 161–168. DOI: 10.1007 / s00294-002-0343-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

32. Wood, S.N. Обобщенные аддитивные модели: введение с R . (Чепмен и Холл / CRC, 2017).

33. Вуд С.Н. Быстрая устойчивая ограниченная оценка максимального и маржинального правдоподобия полупараметрических обобщенных линейных моделей. J. R. Stat. Soc. 2011; 73: 3–36. DOI: 10.1111 / j.1467-9868.2010.00749.x. [CrossRef] [Google Scholar]

Здесь представлены статьи из научных отчетов, любезно предоставленные Nature Publishing Group

Джарет Паттерсон — 2020 — Футбол

Выберите игрока: Аббас Али Ахмед, Таджай Акин младший, Ванкейт Арена, Калеб Ависси, Иордания Авосика, Кайоде Бейкер, Рой Балтар, Джексон Битва, Тахлик Базиль, К.Дж. Черный, Эрик Борланд, Тревор Браун, Э.Дж. Бернистон, Коул Баррелл, Кольбе Бычнски, Тревор Кэхилл, Тревор Дело, Кейси Чемберс, Оуэн Чейз, Аарон Колган, Шон Кук-младший, Рон Корнелиус, Донован Манжета, Хавьен Дэвис, Эван Дэвис младший, Марк Демпси, Майк Дуарон, Деондре Долац, Шон Доти, Тайлер Финеган, Эван Форд-младший, Майкл Фукуа, Маркус Фузак, Джейк Галл, Джейкоб Гэнтли, Эван Гросс-младший, Кори Хейс, Шемар Хайм, Зандер Хилл, Тайрон Крюк, Джеймс Хуз, Мейсон Хадженс, Логика Хадсон, Дацзюань Хантер, Ник Джонсон, Доминик Джонсон, Марлин Джонсон-Мейт, Брайс Царь, Исайя Кленк, Джек Кунсе, Малькольм Лэнг, Кайлер Лаудичина, Энтони Ли, Дэниел Лефевр, Зак Маркс-младший, Кевин Маккарти, Джейсон Макдаффи, Дилан Макги, Рональд Макнейр, Джален Макналти, Алекс Мишель, Макс Миллер-младший, Богатый Молинич, Джейк Молинич, Вятт Майерс, Мэтт Ниас, Джейлен Новицкий, Майк Нанн, Антонио О’Нил, Тайри Паттерсон, Джеймс Паттерсон, Джарет Полгар, Бенце Полицци, Дом Портер, Бернард Пауэлл, Дилан Пайн, Брендан Раззано, Райан Риф, Джакил Райс, Лонни Риггинс, Тейлор Риордан, Иеремия Роббинс, Ларри Робинсон, Кэрон Руис-Наварро, Йовани Шерер, Ален Селовер, Гарретт Шепард, Кэлан Стивенс, Тайлер Тейт, Калеб Терри, Тим Теттех, Майкл Томас-Ишман, Рэй Томпсон, Тайри Тодд, Карлтон Тодд, Сэм Урбаняк, А.Дж. Вантриз, Кайл Уоллес, Гейб Вашингтон, Аапри Westfall, Джексон Уилсон, Эдди Уилсон, Тревор Woetzel, Кит Воло, Джордж Вудс-младший, Тайрис Райт, Кадофи Зикуски, Ник Циммер, Джейк Идти

Позиция
Бегущий назад
Высота
5-9
Вес
195
Класс
Юниор
Родной город
Глендейл, Мэриленд
Старшая школа
Сент-Винсент Паллотти

границ | Аденовирус VA RNAI блокирует олигомеризацию ASC и ингибирует активацию инфламмасомы NLRP3

Введение

Аденовирус-5 человека (Ad5) продуцирует огромные количества специфического класса малых некодирующих РНК, так называемых вирус-ассоциированных (VA) RNAI и VA RNAII [обзор в (1)].Эти многофункциональные РНК необходимы для эффективного размножения вирусов путем воздействия на врожденный иммунный ответ клеток-хозяев. Одна из наиболее охарактеризованных функций VA RNAI — это конкурентный субстрат для интерферон-индуцируемой двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR). PKR, которая является одним из ключевых игроков защиты при большинстве вирусных инфекций (2), активирует сигнальные пути воспалительных клеток и останавливает трансляцию вирусов и клеток посредством фосфорилирования фактора инициации трансляции eIF2α.Чтобы поддерживать эффективную трансляцию во время аденовирусной инфекции, апикальный стержень VA RNAI связывается с PKR, тогда как центральный домен ингибирует активацию PKR, предотвращая аутофосфорилирование (3-5). Интересно, что недавно описанная кристаллическая структура VA RNAI демонстрирует, что апикальный стержень и хорошо законсервированная тетрануклеотидная структура стержня необходимы и достаточны для ингибирования PKR in vitro (6), что, возможно, предполагает, что большая часть центральной области может выполнять дополнительные функции in vivo .Мы и другие продемонстрировали, что терминальный ствол VA РНК преобразуется в маленькие вирусные микроРНК клеточным ферментом Dicer, генерируя так называемые mivaRNAs (7), которые нацелены на пути RNAi / miRNA в инфицированных клетках (8-12).

Помимо своего действия на препятствование инициации трансляции за счет истощения активного eIF2α, PKR также важна для усиления противовирусного ответа после вирусной инфекции (13, 14). Активированный PKR опосредует активацию митоген-активированных протеинкиназ (MAPK) (14, 15), ингибитора киназы κB (IκB) (IKK) (16, 17) и стимулятора IFN-β-промотора 1 (IPS-1). (18).Активация этих путей приводит к усилению экспрессии важных факторов транскрипции, таких как AP1 (19), NF-κB (17) и фактор регуляции интерферона 3 (IRF3) (18), которые участвуют в активации генов, кодирующих провоспалительные цитокины и IFN. .

Вирусная инфекция будет запускать сборку цитозольных мультибелковых комплексов инфламмасом, из которых воспаление NLRP3 (семейство NOD-подобных рецепторов, пириновый домен содержит три) наиболее охарактеризовано (20, 21). Сенсорный белок NLRP3 образует мультимерный комплекс с адаптерным белком ASC (связанный с апоптозом пятнышко, содержащий домен рекрутирования каспазы) и рекрутирует эффекторную молекулу прокаспазу-1.Авторасщепление приводит к продукции активной каспазы-1, которая, в свою очередь, расщепляет провоспалительные цитокины, такие как про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18, с образованием активных ИЛ-1β и ИЛ-18, которые впоследствии секретируются из инфицированной клетки ( 22, 23). Активный IL-1β является одним из ключевых воспалительных цитокинов, вызывающих иммунный ответ, и участвует во многих заболеваниях человека (24). Активация инфламмасомы также приводит к внеклеточному высвобождению ядерного высокоподвижного белка группы 1 (HMGB1), который является ядерным белком, участвующим в регуляции транскрипции (25).Было показано, что высвобождение провоспалительного белка HMGB1 играет роль в нескольких заболеваниях, связанных с инфламмасомами, и аутоиммунных нарушениях (25).

Интересно, что PKR, как предполагается, непосредственно усиливает активацию воспаления и высвобождение HMGB1. Перитонеальные макрофаги, полученные от мышей с дефицитом PKR, высвобождали значительно меньшие количества HMGB1 после обработки поли (I: C) по сравнению с макрофагами от нормальных мышей (26). Было также показано, что PKR взаимодействует с несколькими компонентами инфламмасом (26).Более того, клетки, дефицитные по негативному регулятору PKR, p58IPK, показали повышенную активацию инфламмасом и секрецию цитокинов (27). Однако противоположные результаты позволяют предположить, что PKR незаменима для активации инфламмасом и секреции активных провоспалительных цитокинов (28), и даже что активность киназы PKR имела репрессивный эффект, а не усиливающий эффект на активность инфламмасом (28). Несмотря на это несоответствие, многочисленные исследования подчеркнули важную роль PKR при различных воспалительных заболеваниях (29, 30), хотя для злокачественных состояний были описаны как супрессивная, так и стимулирующая активность (31).Таким образом, результат может зависеть от контекста или зависеть от различных механизмов.

Вирусная инфекция выражает множество сигналов, которые могут запускать активацию инфламмасом множеством вышележащих рецепторов. Аденовирусная инфекция не является исключением, и первые шаги активации инфламмасом происходят, когда вирус проникает через эндосомальную мембрану (32), а датчики цитозольной ДНК распознают вирусную ДНК через AIM2 (33, 34). Также было показано, что путь cGAS / STING (35, 36) распознает ДНК аденовируса и запускает противовирусный ответ (37), хотя это, по-видимому, не влияет на эффективность репликации вируса.

Хотя активация инфламмасом в инфицированных аденовирусом клетках была продемонстрирована экспериментально (38), общая эффективная репликация аденовируса in vivo предполагает, что вирус развил факторы, подавляющие активацию инфламмасом. Например, белок VII Ad5 обладает способностью связывать HMGB1 с ядром, тем самым уменьшая внеклеточную секрецию белка HMGB1 (39). Однако аденовирусный фактор, непосредственно влияющий на активацию инфламмасом, до сих пор не описан.Поскольку Ad5 VA RNAI является хорошо изученным ингибитором активации PKR, мы решили проверить, может ли VA RNAI действовать как супрессор активации инфламмасом. В нашей экспериментальной установке мы стремимся исключить ранние ответы на поступающую ДНК аденовируса и сосредоточиться на событиях во время поздней фазы инфекции, когда экспрессия VA RNAI максимальна. Используя этот подход, мы смогли показать, что VA RNAI действительно блокирует активацию инфламмасомы NLRP3 и тем самым снижает протеолитическую активацию каспазы-1, а также внеклеточное высвобождение HMGB1 и активных форм каспазы-1 и IL-1ß.

Результаты

Ad5 дикого типа, но не вирус, лишенный экспрессии VA RNAI, блокирует высвобождение HMGB1 в клетках THP-1, активированных инфламмасомой NLRP3

Поскольку в нескольких сообщениях было высказано предположение, что активация PKR может играть роль в регуляции инфламмасом, мы проверили, оказывает ли Ad5 VA RNAI, который является хорошо изученным супрессором PKR во время аденовирусной инфекции, ингибирующий эффект на активацию инфламмасом. Клетки THP-1 дифференцировали с помощью PMA для получения макрофагоподобных клеток, а затем инфицировали либо Ad5 дикого типа (Ad WT), либо вирусом dl705 (40), который является мутантным вирусом Ad5, дефектным по экспрессии VA RNAI (здесь упоминается как Ad ΔVAI).Через 48 часов после инфицирования (hpi) среду роста заменяли для удаления потенциальных воспалительных цитокинов, высвобождаемых в ответ на раннюю фазу вирусной инфекции (32), а также сборки и активации инфламмасомы NLRP3, индуцированных классическим агонистом TLR4 LPS, и АТФ (рис. 1А). На экспрессию NLRP3 в клетках THP-1 в конечной точке экспериментальной установки относительно не влияли активация инфламмасом и аденовирусная инфекция (рис. 1B). После этого за активацией инфламмасомы NLRP3 наблюдали путем анализа HMGB1 как в цитозоле, так и в среде для выращивания (рис. 1C).В неинфицированных клетках (Mock) активация инфламмасомы LPS и ATP привела к ожидаемой секреции HMGB1 с незначительным увеличением внутриклеточных уровней HMGB1 (рис. 1C). В клетках, инфицированных Ad WT, количество HMGB1, высвобожденного в среду, было значительно снижено по сравнению с активированными ложно инфицированными клетками (рис. 1C), что свидетельствует о подавляющем эффекте вирусной инфекции. Уменьшение высвобождения HMGB1 не наблюдалось в клетках, инфицированных Ad ΔVAI (фиг. 1C), что указывает на то, что экспрессия VA RNAI необходима для предотвращения высвобождения HMGB1 в инфицированных клетках.Подобное подавление высвобождения HMGB1 вирусом Ad WT наблюдалось в клетках, где вторичный сигнальный АТФ был заменен нигерицином (данные не показаны).

Рисунок 1 . VA RNAI-зависимое ингибирование высвобождения HMGB1 в Ad5-инфицированных клетках THP-1. (A) Схема экспериментальной установки для дифференциации клеток THP-1 до заражения. Потенциальные воспалительные цитокины, высвобождаемые в ответ на раннюю фазу вирусной инфекции, были удалены путем перехода на новую среду и сборки инфламмасомы NLRP3, индуцированной классическим агонистом TLR4 LPS и АТФ. (B) Вестерн-блот-анализ накопления NLRP3 в клетках THP-1 после экспериментальной установки в (A). (C) Вестерн-блот-анализ активированных инфламмасомами (обработанных LPS + ATP) клеток THP-1, инфицированных либо Ad WT, либо Ad ΔVAI, показывающий VA RNAI-зависимое снижение внеклеточного высвобождения HMGB1. (D) Вестерн-блот-анализ, показывающий, что повышенное высвобождение HMGB1 в клетках THP-1, активированных инфламмасомами, Ad ΔVAI коррелирует с повышенным фосфорилированием PKR. (E) Вестерн-блот-анализ капсидных белков Ad5 в Ad WT или Ad ΔVAI-инфицированных клетках THP-1, демонстрирующий фенотипически сходную эффективность трансляции. Во всех панелях актин использовался в качестве контроля загрузки. Лизат; общие клеточные экстракты, sup; секретируемые белки в ростовой среде, ингибитор PKR; Ингибитор PKR 527450), Mock; неинфицированные клетки обрабатывают аналогично инфицированным клеткам. Соотношение данных, приведенное в (C, D) , представляет собой среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.

Единый механизм активации PKR еще не описан (41), но обычно считается, что он требует гомодимеризации и аутофосфорилирования.Участие PKR было продемонстрировано на ранних этапах активации инфламмасом (26), а ингибирование фосфорилирования PKR с использованием ингибитора PKR 527450 (42) уменьшало секрецию HMGB1 в активированных клетках THP-1 (рис. 1D). Высвобождение HMBG1 в активированных инфламмасомами, AdΔVAI-инфицированных клетках коррелировало с сильным увеличением уровня фосфорилированной PKR. Небольшое увеличение фосфорилированной PKR также наблюдалось в активированных инфламмасомами, Ad WT-инфицированных клетках, хотя наблюдалось сильно сниженное высвобождение HMBG1.В целом, по сравнению с нестимулированными клетками THP-1, аденовирусные инфекции вызывали повышенное фосфорилирование PKR, но повышенное высвобождение HMBG1 наблюдалось только после активации инфламмасом и в отсутствие VA RNAI (рис. 1D). Это указывает на то, что VA RNAI может мешать активации инфламмасом, регулируя активацию PKR в клетках THP-1.

В инфицированных аденовирусом клеточных линиях человека эпителиального и фибробластного происхождения VA RNAI играет критическую роль в восстановлении синтеза вирусного белка, предотвращая ингибирование трансляции, вызванное PKR-зависимым фосфорилированием eIF2α [обзор в (1, 43)].Чтобы исключить, что VA RNAI-зависимое снижение высвобождения HMGB1 было связано со сниженной эффективностью трансляции в Ad ΔVAI-инфицированных клетках, позднюю продукцию вирусного белка сравнивали в Ad WT и Ad ΔVAI-инфицированных THP-1 клетках. Как показано на Фигуре 1E, не наблюдалось значительной разницы в накоплении вирусного позднего белка между Ad WT и Ad ΔVAI, что позволяет предположить, что аппарат трансляции в Ad ΔVAI-инфицированных клетках THP-1 был по существу интактным. Результат также подразумевает, что наблюдаемое ингибирование высвобождения HMGB1 в Ad WT-инфицированных клетках не связано с общим VA RNAI-зависимым эффектом на позднюю экспрессию вирусного белка, а скорее связано со специфической функцией VA RNAI.

Активное образование инфламмасом и секреция зрелых провоспалительных цитокинов в клетках THP-1, инфицированных Ad WT, ингибируется VA RNAI

Активация инфламмасомы, помимо высвобождения HMBG1, также характеризуется авторасщеплением прокаспазы-1 в активную субъединицу p20 каспазы-1, которая впоследствии нацелена на про-ИЛ-1β с образованием зрелого ИЛ-1β ( Рисунок 2А). Подобно влиянию на высвобождение HMGB1, инфекция Ad WT ингибировала высвобождение зрелых субъединиц каспазы-1 и IL-1ß в среду (рис. 2А).Напротив, инфицирование Ad ΔVAI не уменьшало накопление секретируемой и протеолитически созревшей каспазы-1 и IL-1β (фиг. 2A), подтверждая гипотезу о том, что VA RNAI требуется для подавления активности инфламмасом.

Рисунок 2 . VA RNAI-зависимое ингибирование секреции зрелой каспазы-1 и IL-1β. (A) Вестерн-блот-анализ активированных инфламмасомой NLRP3 (обработанных LPS + ATP) клеток THP-1, инфицированных либо Ad WT, либо Ad ΔVAI, демонстрирующий VA RNAI-зависимое снижение внеклеточного высвобождения зрелой каспазы-1 и Il- 1ß. (B) Ингибирование высвобождения Il-1β (проанализировано с помощью вестерн-блоттинга), коррелирующего с увеличением накопления VA RNAI (проанализировано с помощью нозерн-блоттинга) во время поздней стадии Ad WT-инфекции клеток ТНР-1, активированных инфламмасомой NLRP3. Анализ проводился в указанные временные точки заражения (hpi). Лизат; общие клеточные экстракты, sup; секретируемые белки в питательной среде, имитация: неинфицированные клетки.

VA RNAI достигает максимального уровня экспрессии на поздней стадии инфекции (44).Таким образом, можно предсказать, что ингибирующий эффект на секрецию цитокинов достигнет максимума при накоплении достаточного количества VA RNAI. Нозерн-блот-анализ временного накопления VA RNAI в активированных клетках THP-1, инфицированных Ad WT, показал обратную корреляцию накопления VA RNAI и секреции IL-1β (рис. 2B). На 48 hpi, когда уровни VA RNAI были наивысшими, уровень секретируемого IL-1ß не определялся (рис. 2B).

Ингибирование пироптозной гибели клеток и образования спеков ASC в клетках, инфицированных Ad WT, зависит от VA RNAI

Поздним последствием активации каспазы-1 и инфламмасом может быть смерть клеток из-за пироптоза (45).В умирающих клетках высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в питательную среду из-за потери целостности мембраны можно количественно оценить как меру гибели клеток. Чтобы проверить, коррелирует ли снижение секреции HMGB1, IL-1β и каспазы-1 в Ad WT-инфицированных клетках (рисунки 1C, D, 2A) со снижением гибели клеток, мы количественно оценили высвобождение LDH в Ad WT или Ad ΔVAI- инфицированные клетки THP-1. В неинфицированных клетках THP-1 активация инфламмасом приводила к ~ 10-кратному увеличению высвобождения ЛДГ. При 48 hpi, но в отсутствие активации инфламмасом, и AdWT, и AdΔVAI высвобождали одинаковые уровни ЛДГ, вероятно, за счет общего цитопатического эффекта.Чтобы конкретно устранить эффект инфламмасомы в инфицированных клетках, среду для роста удаляли при 48 hpi и инфламмасому активировали LPS и АТФ (как показано на рисунке 1A). Затем было обнаружено, что новое высвобождение ЛДГ было значительно меньше в клетках, инфицированных AdWT, по сравнению с клетками, инфицированными AdΔVAI (фиг. 3A), что позволяет предположить, что VA RNAI защищает клетки от пироптотической гибели клеток.

Рисунок 3 . Снижение (пироптотической) гибели клеток в клетках THP-1, инфицированных AdWT. (A) Количественная оценка высвобождения ЛДГ в необработанных или активированных инфламмасомой NLRP3 (обработанных LPS + ATP) клетках THP-1, неинфицированных (правая панель) или после инфицирования Ad WT или Ad ΔVAI, демонстрирующих VA RNAI-зависимое подавление гибель клеток в инфламмасомах активировала клетки THP-1.Высвобождение ЛДГ из инфицированных, но нестимулированных клеток определяли при 48 hpi (левая панель). Высвобождение ЛДГ из инфицированных клеток после активации инфламмасом осуществляли в соответствии с экспериментальной схемой на рисунке 1А (средняя панель). Высвобождение ЛДГ определяли количественно с помощью анализа восстановления NAD ⁺ (относительная флуоресцентная единица; RFU). (B) VA RNAI-зависимое снижение образования пятен ASC в NLRP3-активированных инфламмасомами клетках THP-1, экспрессирующих YFP-ASC, либо неинфицированных (имитация), либо инфицированных Ad WT или Ad ΔVAI.Для сравнения были выбраны изображения с одинаковым общим количеством ячеек / спецификаций. (C) Количественное определение количества точек ASC, замеченных в (B) . Для каждого образца числа представляют собой среднее количество точек, подсчитанных из 10 отдельных полей. Количественные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводился с помощью непарного t -теста *** p <0,001; n.s., не имеет значения.

Смерть клеток в результате пироптоза происходит после рекрутирования адапторного белка ASC (связанный с апоптозом пятнышкообразный белок, содержащий карбоксиконцевой домен рекрутирования каспазы) и эффекторной прокаспазы-1 на сенсорный белок NLRP3. Активация активированных инфламмасом приведет к образованию так называемых пятен ASC, за которыми сразу же следует гибель клеток (46). Однако внеклеточные пятнышки ASC преобладают достаточно долго, чтобы их можно было считать мерой активации инфламмасом.Чтобы непосредственно проанализировать образование пятен, мы инфицировали клетки THP-1, стабильно экспрессирующие YFP-меченый ASC (47), с помощью Ad WT или Ad ΔVAI, и индуцировали инфламмасому NLRP3 с помощью LPS + ATP. Результат показан на Рисунке 3B, а количественная оценка образования пятен ASC — на Рисунке 3C. В неинфицированных и необработанных клетках THP-1 было обнаружено очень мало спецификаций, а белок YFP-ASC был равномерно распределен по всей клетке (рис. 3B). Аналогичная картина наблюдалась в клетках, инфицированных Ad WT. Это резко контрастировало с Ad ΔVAI-инфицированными клетками, где YFP-ASC образовывал почти в четыре раза больше пятен, наблюдаемых в активированных ложных клетках или инфицированных Ad WT клетках (рис. 3C).Взятые вместе, эти наблюдения продемонстрировали, что VA RNAI блокирует образование активной инфламмасомы NLRP3.

Эктопическая экспрессия аденовируса VA RNAI достаточна для ингибирования активности инфламмасомы NLRP3

Чтобы определить, достаточно ли VA RNAI для ингибирования активации инфламмасом в отсутствие других компонентов вируса, мы трансдуцировали активированные клетки THP-1 с помощью вектора AdEasy, экспрессирующего ген VA RNAI дикого типа (AdEasy WT) или транскрипционно дефектный ген VA RNA I. (AdEasy ΔVAI) (48).Нереплицирующаяся вирусная векторная система AdEasy (49) обеспечивает эффективную экспрессию VA RNAI в отсутствие продуктов других вирусных генов или репликации вирусной ДНК. По сравнению с AdEasy ΔVAI, AdEasy WT подавлял высвобождение HMGB1, каспазы-1 и IL-1ß (рис. 4A). В соответствии с нашими предыдущими данными, клетки THP-1, трансдуцированные AdEasy WT, также снижали фосфорилирование PKR (рис. 4A). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что VA RNAI в отсутствие продуктов других вирусных генов достаточно для ингибирования активности инфламмасомы NLRP3.

Рисунок 4 . Эктопическая экспрессия аденовируса VA RNAI достаточна для подавления высвобождения провоспалительных цитокинов. (A) Вестерн-блот-анализ активированных инфламмасомой NLRP3 (обработанных LPS + ATP) клеток THP-1, инфицированных AdEasyWT или AdEasyΔVAI с дефицитом репликации, демонстрирующий VA RNAI-зависимое снижение высвобождения каспазы-1, Il-1ß и HMGB1. (B) Вестерн-блот-анализ, демонстрирующий ингибирование высвобождения каспазы-1, Il-1β и HMGB1 в клетках THP-1, активированных NLRP3 (обработанных LPS + ATP), трансфицированных in vitro транскрибированной VA RNAI.Ctrl РНК; in vitro транскрибировал РНК того же размера, что и VA RNAI, но с неродственной последовательностью.

Чтобы еще раз доказать эту точку зрения, дифференцированные PMA клетки THP1 трансфицировали in vitro транскрибированной VA RNAI или контрольной РНК той же длины, но с неродственной последовательностью. Через двенадцать часов после трансфекции клетки стимулировали LPS + ATP для активации инфламмасомы NLRP3. Хотя трансфекция редко достигает такой же высокой эффективности, как трансдукция вируса, , синтезированная in vitro VA RNAI, продемонстрировала явный ингибирующий эффект на высвобождение HMGB1, каспазы-1 и IL-1β по сравнению с , синтезированной in vitro контрольной РНК (рис. 4B). ).Важно отметить, что , синтезированный in vitro VA RNAI, также показал снижение фосфорилирования PKR, не влияя на общее количество PKR.

VA Связывание РНКи с PKR необходимо для ингибирования активности инфламмасомы NLRP3

Корреляция между вторичной структурой VA RNAI аденовируса (рис. 5A) и его регуляцией активности PKR была тщательно исследована (43). Спаривание оснований высококонсервативного центрального домена и характер оцРНК и дцРНК апикальной структуры в VA RNAI (рис. 5A) имеют решающее значение для взаимодействия VA RNAI-PKR и функции VA RNAI in vivo и in vitro (3 –5).Используя высокопроизводительное секвенирование РНК, выделенной УФ-сшиванием и иммунопреципитацией PKR (HITS-CLIP) в сочетании с биоинформатическим анализом, мы идентифицировали последовательности, защищенные PKR в клетках THP-1, инфицированных Ad5 VAI (фигура 5A, серые прямоугольники). Результат демонстрирует, что апикальный стержень и петля, по-видимому, являются наиболее заметным сайтом связывания для PKR (дополнительный рисунок 1). Хотя VA RNAII складывается в структуру шпильки, аналогичную VA RNAI, результаты PKR HITS-CLIP для VA RNAII показывают значительно меньше считываний, которые, кроме того, картируются только с концевой областью ствола VA RNAII (дополнительный рисунок 1).Этот результат согласуется с наблюдением, что VA RNAII может только в очень ограниченной степени защищать вирусную трансляцию во время литической аденовирусной инфекции.

Рисунок 5 . Связывание PKR с VA RNAI необходимо для ингибирующего действия на высвобождение провоспалительных цитокинов. (A) Схематическая диаграмма, показывающая структуру РНК1 VA дикого типа Ad5, расположение мутанта L1, несущего мутацию, нарушающую спаривание оснований в консервативном центральном домене, необходимом для связывания PKR, и мутант L1-R1, несущий компенсаторную мутацию восстановление спаривания оснований в центральном домене.Серые прямоугольники представляют последовательности РНК, идентифицированные анализом HITS-CLIP как защищенные связыванием PKR (см. Также дополнительный рисунок 1). (B) Вестерн-блот-анализ, демонстрирующий ингибирование высвобождения каспазы-1, Il-1ß и HMGB1 в активированных инфламмасомами NLRP3 (обработанных LPS + ATP) клетках THP-1, трансфицированных in vitro. транскрибировал VA RNAI, неактивный мутант. L1 или компенсаторная мутация L1-R1.

Мутация, нарушающая спаривание оснований консервативной пары тетра-нуклеотидов, GGGU и ACCC (мутант L1, фиг. 5A), снижает способность VA RNAI восстанавливать PKR-индуцированное ингибирование трансляции (3, 4).Однако VA RNAI восстанавливает большую часть своей активности, когда спаривание оснований восстанавливается путем введения компенсаторных мутаций (L1-R1, рисунок 5A). Чтобы убедиться, что взаимодействие VA RNAI с PKR также необходимо для наблюдаемого ингибирующего эффекта на инфламмасому NLRP3, Ad5 VA RNAI дикого типа, мутанты VA RNAI L1 и VA RNA L1-R1 (рис. 5A) были in vitro транскрибируется и трансфицируется в клетки THP-1 (рис. 5B). И VA RNAI дикого типа, и VA RNAI L1-R1 ингибировали высвобождение HMGB1, каспазы-1 и IL-1ß, тогда как мутант VA RNAI L1 с нарушенным спариванием оснований не смог этого сделать (рис. 5B).Взятые вместе, эти наблюдения подтверждают гипотезу о том, что VA RNAI оказывает ингибирующее действие на инфламмасому NLRP3 посредством связывания с PKR.

VA РНКИ блокирует олигомеризацию ASC

Ранее было показано, что PKR

взаимодействует с NLRP3, а также необходима для восстановления активного комплекса инфламмасом в трансфицированных клетках HEK293 (26). Здесь мы показали, что VA RNAI не влияет на общее количество PKR, но, хотя и в разной степени, снижает накопление активированной фосфорилированной формы PKR.Следовательно, VA RNAI теоретически может блокировать существенное взаимодействие между PKR и компонентом (ами) инфламмасомы и / или ингибировать PKR-зависимое фосфорилирование мишени (ей) инфламмасомы. Чтобы рассмотреть различные возможности, мы проанализировали влияние VA RNAI на взаимодействие компонентов инфламмасомы в клетках HEK293, стабильно экспрессирующих белок YFP-ASC и котрансфицированных плазмидами, экспрессирующими белок PKR с меткой Flag и слитый белок NLRP3 с меткой GFP. . Экстракты из Ad WT и Ad ΔVAI-инфицированных клеток подвергали иммунопреципитации с помощью антитела против Flag, и вестерн-блоттинг зондировали первичными антителами для обнаружения PKR и соосажденного NLRP3.Как показано на рисунке 6А, мы наблюдали слабое взаимодействие между PKR и NLRP3 в инфицированных клетках. Однако не наблюдали разницы между Ad WT или Ad ΔVA-инфекцией в относительном связывании между PKR и NLRP3 (фиг. 6A), предполагая, что VA RNAI не подавляла образование комплекса инфламмасом на уровне взаимодействия PKR-NLRP3. При использовании той же стратегии коиммунопреципитации новое взаимодействие между PKR и YFP-ASC наблюдалось в Ad ΔVAI-инфицированных клетках (фиг. 6B). Интересно, что взаимодействие было явно снижено в клетках, инфицированных Ad WT (фиг. 6B).Примечательно, что даже в отсутствие Flag-PKR были обнаружены небольшие количества YFP-ASC (фиг. 6B), что позволяет предположить, что трансген YFP-ASC экспрессировался на высоких уровнях или что белок имеет общую липкость.

Рисунок 6 . VA RNAI блокирует фосфорилирование и олигомеризацию ASC. Клетки HEK293, стабильно экспрессирующие YFP-ASC и котрансфицированные плазмидами, экспрессирующими PKR с меткой Flag и слитый белок NLRP3 с меткой GFP, инфицировали Ad WT или Ad ΔVAI, и клеточные лизаты подвергали иммунопреципитации антителами против Flag. (A) Вестерн-блоттинг соосажденных NLRP3 и PKR с использованием анти-GFP и анти-Flag-антител, соответственно демонстрирующий независимое от VA RNAI взаимодействие между NLRP3 и PKR. (B) Вестерн-блот-анализ соосажденных ASC и PKR с использованием анти-YFP и анти-Flag-антител, соответственно, демонстрирующий VA RNAI-зависимое ингибирование взаимодействия между ASC и PKR. (C) Вестерн-блот-анализ фосфорилированных ASC с использованием фосфо-Tyr146-специфического антитела, демонстрирующего VA RNAI-зависимое ингибирование фосфорилирования ASC. (D) Гранулы нерастворимых клеток ТГР-1 Тритон-Х100, поперечно сшитые с 4 мМ дисукцинимидиловым субератом для сохранения олигомеров ASC. Образцы, растворенные в буфере для образцов SDS, подвергали Вестерн-блоттингу для обнаружения ASC, демонстрирующего VA RNAI-зависимое ингибирование олиогмеризации ASC. Отношение данных рассчитывали как сумму олигомеров и димеров по сравнению с мономерами.

Ранее было продемонстрировано, что фосфорилирование ASC необходимо для образования олигомеров ASC (50–52).Как показано на фиг. 3B, C, Ad WT, но не Ad ΔVAI, может блокировать образование спецификаций ASC, результат, который предполагает, что VA RNAI препятствует фосфорилированию ASC и / или олигомеризации ASC. Сравнение уровня фосфорилирования ASC в Ad WT и Ad ΔVAI-инфицированных клетках THP-1 продемонстрировало меньшее фосфорилирование ASC в клетках, инфицированных Ad WT (фиг. 6C). Чтобы убедиться, что это также снижает олигомеризацию ASC, мы использовали комбинацию экстракции Triton X100 и сшивания дисукцинимидилового суберата (DSS) для получения олигомеров ASC (53, 54) из Ad WT и Ad ΔVAI-инфицированных и NLRP3-активированных инфламмасомами клеток THP-1. .В соответствии с VA RNAI-зависимым ингибированием фосфорилирования ASC (рис. 6C) и ингибированием образования specs (рис. 3B, C), мы наблюдали, что инфекция Ad WT также снижает образование олигомера ASC (рис. 6D). Взятые вместе, наши результаты предполагают, что VA RNAI блокирует взаимодействие между PKR и ASC, чтобы ингибировать фосфорилирование ASC и, следовательно, олигомеризацию ASC.

Химера концевого ствола РНКП VA, экспрессирующая miR-146, снижает накопление TRAF6, сохраняя при этом способность ингибировать инфламмасому NLRP3

Результаты, показанные на фиг. 5, согласуются с моделью, в которой взаимодействие между апикальным стволом и центральным доменом VA RNAI, а PKR отвечает за наблюдаемое ингибирование инфламмасомы NLRP3.Мы и другие показали, что терминальный ствол VA RNAI (рис. 5A) процессируется в небольшие вирусные микроРНК (так называемые mivaRNAs) со способностью вмешиваться в пути RNAi / miRNA в инфицированных клетках. Чтобы проверить, участвуют ли mivaRNA в активации инфламмасомы, VA RNAI с мутациями в семенных последовательностях (48) анализировали на их способность ингибировать инфламмасому. Как показано на Фигуре 7A, репликационно-компетентные вирусы Ad5 с мутациями в 3′- или 5′-последовательностях (Ad ^* VAI 5’m и Ad ^* VAI 3’m) были, по крайней мере, столь же эффективны, как Ad WT в предотвращение фосфорилирования PKR и блокирование высвобождения каспазы-1 в клетках THP-1.Таким образом, мы пришли к выводу, что функция VA RNAI как ингибитора активации воспаления NLRP3 не зависит от способности VA RNAI продуцировать нативные mivaRNAs.

Рисунок 7 . Химера терминального стебля VA RNAI, экспрессирующая miR-146, снижает накопление TRAF6, сохраняет способность ингибировать инфламмасому NLRP3. (A) Вестерн-блот , показывающий, что репликационно-компетентные вирусы Ad5 с мутациями в 5′- или 3′-последовательностях VA RNAI (Ad * VAI 5’m и Ad * VAI 3’m) были столь же эффективны, как Ad WT в предотвращении фосфорилирование PKR и блокирование высвобождения каспазы-1. (B) Схематическая диаграмма, показывающая последовательность химеры Ad5 VA RNAI / miR-146. (C) Клетки HEK293, котрансфицированные in vitro , транскрибированные VA РНК1 или VA146 дикого типа и репортеры люциферазы, содержащие или не имеющие сайт связывания miR-146 с мРНК TRAF6, демонстрируют зависимую от miR146 репрессию люциферазной активности. (D) Вестерн-блот-анализ, показывающий, что трансфекция in vitro транскрибированного VA146 подавляет экспрессию эндогенного белка TRAF-6 в клетках THP-1, активированных инфламмасомой NLRP3 (обработанных LPS + ATP). (E) Вестерн-блот-анализ, показывающий, что in vitro транскрибирует VAI146, а РНК1 VA дикого типа ингибируют высвобождение IL-1β в клетках THP-1, активированных NLRP3 (обработанных LPS + ATP). Количественные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводился с помощью непарного t -теста *** p <0,001; n.s. незначительный.

Это открытие открыло возможность создания перенаправленного гена VA RNAI со способностью модулировать конкретный клеточный ген через пути RNAi / miRNA.Мы выбрали клеточный miR-146, который, как было показано, контролирует передачу сигналов TLR и цитокинов через регуляторную петлю отрицательной обратной связи, включающую понижающую регуляцию киназы 1, связанной с рецептором IL-1 (IRAK), и фактора 6, связанного с рецептором TNF (TRAF6). уровень белка (55). Конечная последовательность в Ad5 VA RNAI была заменена последовательностью miR-146a (56) для получения химеры VA RNAI miR-146 (VAI146; фигура 7B). После транскрипции in vitro VAI146 котрансфицировали люциферазными репортерными конструкциями в клетки HEK293.Как показано на рисунке 7C, VA146, по-видимому, продуцирует функциональную miR-146, поскольку наблюдалась специфическая репрессия активности люциферазы, но только тогда, когда последовательность-мишень miR-146 из 3′-UTR TRAF6 была вставлена в 3′-UTR люциферазная репортерная конструкция. Более того, сравнение in vitro транскрибированных VA RNAI и VA146 после трансфекции клеток THP-1 показало, что уровни эндогенного белка TRAF6 были специфически снижены в клетках, трансфицированных VA146 (фигура 7D). Важно отметить, что VA146 был так же эффективен, как VA RNAI дикого типа в отношении ингибирования высвобождения каспазы-1, что позволяет предположить, что перенацеленная mivaRNA не влияет на способность VA RNAI ингибировать активацию инфламмасом (фигура 7E).

Обсуждение

Инфекция аденовирусом человека приводит к активации нескольких врожденных иммунных активностей в инфицированной клетке. Например, активация факторов транскрипции, таких как IRF3 и NF-κB, может приводить к транскрипции IFN-β и провоспалительных цитокинов, активация PKR дцРНК может в конечном итоге остановить трансляцию, а вирусная ДНК может активировать каспазу-1 через сигнальный путь воспаления. Тем не менее, вирус запускает ряд контрмер, которые необходимы вирусу для создания продуктивной инфекции.Например, белки E1A блокируют активацию транскрипции интерферона (57, 58), VA RNAI предотвращает активацию PKR (59, 60), а вирусный гистоноподобный белок VII связывается и секвестрирует HMGB1 с хроматином (39), тем самым предотвращая его высвобождение. и стимулирующее действие на провоспалительные процессы.

В предыдущей работе было показано, что аденовирус активирует инфламмасому NLRP3 на ранних этапах инфицирования через TLR9, воспринимая двухцепочечную ДНК вируса после проникновения через эндосомную мембрану (32).В этой работе мы сосредоточились на том, как Ad5 справляется с провоспалительным ответом на поздних сроках инфицирования. Для этого были удалены провоспалительные цитокины, высвобождаемые в питательную среду во время ранней фазы инфекции. Вместо этого активация инфламмасом индуцировалась на поздней стадии инфекции с использованием классического праймингового агониста TLR4 LPS и активатора инфламмасомы АТФ.

Были представлены противоречивые результаты относительно того, участвует ли и как PKR в активации инфламмасом.Эти результаты варьируются от полного отсутствия эффекта (61) до активации (26, 27, 62, 63) или ингибирования (28) активности инфламмасом. Поскольку Ad5 VA RNAI является известным ингибитором PKR, мы решили изучить влияние VA RNAI на активацию инфламмасом. Наши результаты убедительно подтверждают мнение, что PKR играет роль в активации воспаления NLRP3. Мы также описываем новую способность VA RNAI per se ингибировать PKR-зависимую активацию инфламмасомы NLRP3. Данные основаны на трех различных подходах: введение VA RNAI в клетки THP-1 через; (i) инфицирование компетентным к репликации аденовирусом со способностью экспрессировать VA RNAI или без нее; (ii) трансдукция гена VA RNAI с использованием дефектной по репликации векторной системы AdEasy и (iii) трансфекция in vitro транскрибированных молекул дикого типа или мутантных молекул VA RNAI.Первые два подхода продемонстрировали, что VA RNAI необходима для блокирования LPS + ATP стимулированной активации NLRP3 инфламмасом. На ранней стадии аденовирусной инфекции вирусная ДНК распознается AIM2, который рекрутирует ASC для формирования комплекса инфламмасом (33). Таким образом, возможно, что VA RNAI также оказывает ингибирующее действие на инфламмасому AIM2, даже если цитокины, секретируемые из-за зондирования вирусной ДНК, были удалены до анализа ингибирования в нашем исследовании. Более того, также возможно, что VA RNAI, экспрессируемая вектором AdEasy, может ослаблять дополнительную противовирусную активность, индуцированную поступающей вирусной ДНК, что, возможно, объясняет наблюдаемую вариацию про-IL-1ß (рис. 4A).Однако, поскольку VA RNAI в основном экспрессируется в более поздние моменты литической инфекции (44) (рис. 2B), ее роль в качестве потенциального регулятора инфламмасомы AIM2 здесь не рассматривается. Важно отметить, что наш третий подход, который включает введение in vitro синтезированной VA RNAI, продемонстрировал, что одной VA RNAI было достаточно для блокирования инфламмасомы NLRP3, измеренной по секреции HMGB1 и протеолитически процессируемой каспазы-1 и IL-1ß. В этом подходе VA RNAI была произведена с использованием РНК-полимеразы T7, процедурой, которая может вызывать нежелательную транскрипцию с противоположной цепи матрицы, что приводит к продукции dsRNA с потенциально иммуностимулирующей активностью (64).Активация PKR дцРНК, продуцируемая РНК-полимеразой Т7, транскрипция гена мяРНК была недавно продемонстрирована (65). Однако мы не наблюдали влияния на инфламмасому NLRP3 ни контрольной РНК, продуцируемой РНК-полимеразой Т7, ни мутантного гена VA РНК I, ранее описанного для отсутствия регуляторной активности PKR. Таким образом, мы заключаем, что потенциальная продукция дцРНК из матриц, используемых в этом исследовании, не маскировала специфическую блокирующую активность VA RNAI.

Примечательно, что в то время как инфекция AdWT блокировала активность инфламмасомы NLRP3 по сравнению с неинфицированными клетками (рис. 1C), инфицирование вектором AdEasy с дефектом репликации, по-видимому, усиливало высвобождение IL-1β и HMGB1 по сравнению с неинфицированными клетками (рис. 4A).Следовательно, возможно, что инфицирование клеток THP-1 компетентным к репликации Ad5 может привести к экспрессии других вирусных факторов, которые могут мешать передаче провоспалительных сигналов. Одним из таких примеров является белок VII Ad5, который, как было показано, секвестрирует HMGB1 в ядре (39).

Хорошо подтвержденный механизм, с помощью которого VA RNAI предотвращает индуцированное PKR ингибирование трансляции, описывает процесс, при котором VA RNAI связывает мономер PKR, тем самым предотвращая димеризацию, аутофосфорилирование и, таким образом, активацию [rev. (1, 43)].Апикальный стержень VA RNAI важен для связывания с высокой аффинностью и ингибирования активности PKR, тогда как вклад центрального домена, включая образование псевдоузла, менее очевиден (3–5, 66). С другой стороны, консервативная тетрануклеотидная пара в VA RNAI имеет решающее значение для связывания PKR и ингибирования активации PKR как in vivo, , так и in vitro (3-5). В недавно опубликованной кристаллической структуре VA RNAI было показано, что тетрануклеотидная пара вместе со стержнем апикального дуплекса является необходимой и достаточной для предотвращения активации PKR (6).Используя HITS-CLIP-анализ взаимодействия VA RNAI-PKR, мы показали, что последовательности в апикальной и центральной областях VA RNAI были защищены связыванием PKR. Однако прямого связывания PKR с парами тетрануклеотидных оснований не наблюдалось. Тем не менее, мутации в паре тетрануклеотидов, которые, как известно, мешают ингибированию PKR, также препятствуют способности VA RNAI ингибировать активацию инфламмасом (рис. 5). Более того, компенсаторная мутация, которая, как известно, восстанавливает ингибирование PKR, также устраняет дефект, связанный с блокированием инфламмасомы.Компенсаторный мутант L1-R1 (фиг. 5A) был менее эффективен в блокировании каспазы-1 и высвобождения цитокинов по сравнению с VA RNAI дикого типа (фиг. 5B), что согласуется с его примерно половиной активности в отношении ингибирования активации PKR (4). Поскольку снижение фосфорилирования PKR наблюдалось параллельно с VA RNAI-зависимым ингибированием инфламмасомы, наши данные показывают, что ингибирование VA RNAI активации воспаления NLRP3 может действовать посредством известного механизма ингибирования активации PKR. Механизм, с помощью которого PKR активирует образование инфламмасом, является предметом обсуждения.Лу и др. (26) продемонстрировали взаимодействие между PKR и NLRP3, и что PKR, лишенная киназной активности, нарушается при активации инфламмасом. В этом отчете мы демонстрируем, что PKR также физически взаимодействует с ASC. Мы показываем, что VA RNAI ингибирует взаимодействие между PKR и ASC, но не взаимодействие между PKR и NLRP3 (рис. 6). Кроме того, характерное образование пятен, вызванное стимуляцией инфламмасом, значительно снижалось в присутствии VA RNAI (рис. 3).Образование пятен является признаком активных инфламмасом NLRP3 и требует фосфорилирования ASC и последующей олигомеризации ASC (50). Таким образом, было важным наблюдение, что фосфорилирование ASC блокируется VA RNAI-зависимым механизмом. Ряд тирозинкиназ участвует в фосфорилировании ASC (51), и мутация высококонсервативного Tyr 146, по-видимому, отменяет как образование пятен ASC, так и активацию инфламмасом (50). PKR характеризуется как серин / треонинкиназа, но активация домена киназы PKR требует межмолекулярного аутофосфорилирования остатков тирозина, когда латентные мономеры PKR димеризуются (11).Таким образом, PKR представляет собой киназу с двойной специфичностью, но до сих пор фосфорилирование тирозина не участвовало больше, чем в регуляции димеризации PKR (67).

Следует также отметить, что, поскольку другие протеазы также способны расщеплять IL-1ß, некоторые даже независимо от ASC, мы не можем исключить, что может быть задействован другой механизм с альтернативной зависимостью PKR.

В совокупности наши данные подтверждают механизм, при котором PKR стимулирует активацию инфламмасом и, кроме того, VA RNAI ингибирует активацию инфламмасом, блокируя взаимодействие между PKR и ASC, которое в противном случае привело бы к фосфорилированию и олигомеризации ASC.Как следствие ингибирования инфламмасом, VA RNAI ограничивает образование пятнистых структур (пироптосом), содержащих ASC (рис. 3), тем самым защищая клетки от пироптотической гибели клеток. Хотя в этом отчете это только показательно, будет интересно продолжить изучение возможности усиления ингибиторной активности VA RNAI в отношении инфламмасом путем конструирования гибридов VA RNA-miRNA, таких как химера VA RNAI-miR-146 (Рисунок 7), нацеленных на другие важные компоненты, участвующие в активации инфламмасом.

Аберрантная активация инфламмасом связана с различными неврологическими, аутоиммунными, сердечно-сосудистыми и злокачественными заболеваниями (68). При вирусных инфекциях провоспалительные реакции могут при хронических инфекциях приводить к долгосрочному воспалению, тем самым создавая риск для различных состояний здоровья. Представленный здесь результат о том, что малая молекула вирусной РНК может ослабить активность инфламмасом, потенциально может улучшить наше понимание того, как сдерживать воспаление.

Материалы и методы

Вирусы и плазмиды

Вирусы, использованные в этом исследовании, представляли собой Ad5 дикого типа (обозначаемый как Ad WT), мутантный вирус VA RNAI ^— / VA RNAII ⁺ dl705 (40) (здесь обозначается как Ad ΔVAI) и вирусы с дефектом репликации AdEasy WT и AdEasy ΔVAI (48).Для создания репликационно-компетентных вирусов AdEasy, экспрессирующих мутации 5′- и 3′-семенной последовательности VA RNAI (48), мы использовали гомологичную рекомбинацию для повторного введения генов VA RNAI с мутированными семенами в их нормальное хромосомное положение в единицах карты 30, тем самым генерируя Ad ^* — VAI 5′m и Ad ^* VAI 3′m. Подробная информация о стратегиях клонирования предоставляется по запросу. Плазмиды, экспрессирующие VA RNAI с промотора T7, были описаны ранее (8). Ad5 VA RNAI L1 и VA RNAI L1-R1-мутанты с мутациями центрального стеблевого домена (фиг. 5A) были химически синтезированы (Genscript) и клонированы компанией в pUC19 в качестве рестрикционного фрагмента XbaI / EcoRI.PKR с меткой FLAG (N-DDK (Flag ^®) был получен из Sino Biological, а белки NLRP3 с меткой GFP (PEGFP-C2 NLRP3) от Addgene. Фрагмент 3’UTR TRAF6 из 940 пар оснований, содержащий три связывающих сайтов для miR-146a, был клонирован в плазмиду pMirGlo (Promega) в качестве фрагмента рестрикционного фермента PmeI-SacI. Вкратце, цитоплазматическая РНК из клеток HeLa была преобразована в кДНК с использованием набора SuperScript III First-Strand Synthesis (Thermo Fisher Scientific company). и 3’UTR-ПЦР TRAF6 была впоследствии амплифицирована с использованием прямого праймера AAAGTGAAAATCACTACCGCCT и обратного праймера GCGAGCTCGTACCAGACAACTTTAAATGGTGGA.Ad5 VA RNAI L1 и Ad5 VA RNAI L1-R1-мутанты с мутациями центрального стеблевого домена (рис. 5A) и химера Ad5 VA146 (рис. 7A) были химически синтезированы (Genscript) и клонированы компанией в pUC19 как XbaI. / Фрагмент рестрикции EcoRI.

Сотовые линии

Клетки

THP-1 (ATCC ^® TIB-202) поддерживали в виде суспензионных культур в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина, 1 мг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина B, 1% мл 100 × незаменимых аминокислот (Gibco Thermo Fisher), 10 мМ буфера HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 2 мМ глутамина.Дифференциация клеток THP-1 в монослои макрофагоподобных клеток была достигнута путем посева клеток на чашки и стимуляции в течение 24 часов 100 нМ форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA; EMD Chemicals). Клетки THP-1, стабильно экспрессирующие shRNA, направленные против ASC (47) или стабильно экспрессирующие слитый белок YFP-ASC, поддерживали в среде RPMI 1640 с добавками, как указано выше. Клетки HEK293 (ATCC) и HEK293, стабильно экспрессирующие передачу сигналов TLR4-MyD 88 вместе с YFP-ASC (69) (Гаврилин и др., Личное сообщение) поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 100 МЕ / мл пенициллина, 1 мг / мл. стрептомицин и 0.25 мкг / мл амфотерицина В.

Инфекции и активация инфламмасомы NLRP3

Через 48 часов после обработки PMA монослои активированных клеток THP-1 инфицировали 20 FFU / клетку указанных аденовирусов. 48 hpi, ростовую среду заменяли бессывороточной DMEM и активировали инфламмасому NLRP3 путем праймирования 500 нг / мл LPS (Invivogen) в течение 5 часов с последующим добавлением либо 5 мМ АТФ (Sigma-Aldrich), либо 20 нМ нигерицина ( Токрис) на 30 мин. Когда указано, ингибитор PKR 527450 (CAS 608512-97-6 — Calbiochem; Sigma-Aldrich), растворенный в ДМСО, добавляли к клеткам THP-1 в концентрации 0.1 мкМ за 2 ч до активации воспаления NLRP3.

Сбор лизата и супернатанта белка

Для анализа секретируемых белков среду роста собирали и центрифугировали при 14000 × g в течение 15 минут при 4 ° C для удаления клеточного мусора. Один мл супернатанта переносили в свежую пробирку на 1,5 мл, содержащую 10 мкл смолы StrataClean (Agilent Technologies). Через 1 час на вращающемся колесе при 4 ° C белки, связанные со смолой, собирали путем кратковременного центрифугирования и после этого элюировали путем ресуспендирования в 30 мкл 1 × буфера Лэммли.Общие клеточные лизаты получали лизисом клеток путем инкубации со 100 мкл буфера RIPA в течение 1 часа с последующим переносом лизата в пробирку на 1,5 мл. Добавляли равный объем 2X буфера Лэммли и образцы нагревали при 95 ° C в течение 5 минут перед тем, как разделить на 10% SDS-PAGE.

Иммуноблоттинг

Двенадцать микролитров супернатанта или клеточного лизата разделяли на 4–12% геле Mini-Protean TGX (Bio-Rad) при 100 В в течение 1 часа. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны 0,2 мкм (Li-Cor Biotechnology) при 100 В в течение 1 часа.Мембраны были заблокированы в 5% обезжиренном сухом молоке в PBS, содержащем 0,2% Tween-20, в течение 1 часа с последующей инкубацией в PBS, содержащем 5% BSA, 0,2% Tween-20 и либо 1: 1000 кроличьих поликлональных антител против каспазы- 1 p20 (47), анти-IL-1β (70), анти-HMGB1 (abcam; ab18256), анти-PKR (фосфо T446) (abcam; ab32036), анти-PKR (abcam; ab226819), анти-бета-актин антитело (abcam; ab8229), антитело против GFP (abcam; ab6556) или фосфо-специфическое антитело против Asc (Tyr-144) 1: 500 (ECM Bioscience; AP5631) с вращением в течение ночи при 4 ° C.На следующий день наносили вторичные антитела осла против кроличьего IRDye 800CW и ослиного против козьего IRDye 680RD (Li-Cor Biotechnology) в разведении 1:15 000 при покачивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны получали на аппарате Li-Cor Odyssey CLx с автоматической экспозицией и настройкой высокого качества.

Анализ цитотоксичности лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Анализ восстановления NAD ⁺ (Roche Applied Science) использовали для количественного определения высвобождения ЛДГ из клеток. Среду для выращивания собирали и осветляли центрифугированием при 400 g в течение 5 мин, и концентрацию LDH в среде измеряли при 490 нм.Гибель клеток рассчитывалась по формуле: цитотоксичность (%) = [(образец-пустой) / (положительный контроль-пустой) × 100], где пустое поле указывает значение OD для формы RPMI-1640, а значения OD положительного контроля, определенные как общее содержание LDH в необработанные клетки THP1 лизировали 1% Triton X-100.

Визуализация ASC Speck с использованием ячеек YFP-ASC THP1

Для микроскопии 10 ⁶ клеток THP-1, стабильно экспрессирующих YFP-ASC, высевали в 6-луночный культуральный планшет (Costar) в общем объеме 2 мл / лунку. Клетки инфицировали, как описано выше, и воспаление NLRP3 активировали обработкой LPS + ATP.Пятнышки ASC были визуализированы с помощью системы визуализации EVOS M7000, инвертированного микроскопа с использованием возбуждения 480/20 нм и детектирования при излучении 520 нм под объективом 40X. Флуоресцентные изображения пятен ASC количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image J (NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij).

Высокопроизводительное секвенирование РНК, выделенной с помощью УФ-перекрестной сшивки и иммунопреципитации (HITS-CLIP) и биоинформатического анализа

HITS-CLIP и подготовку библиотеки выполняли в основном, как описано (71) со следующими модификациями: через 24 часа на дюйм клетки THP1 (фиктивные или Ad WT) дважды промывали PBS и дважды облучали 400 мДж / см. ² при 254 градусах. нм.Лизат клеток инкубировали либо с анти-PKR (abcam), либо с анти-GFP отрицательным контролем (abcam). Считанные исходные последовательности были обрезаны с помощью Cutadapt (72) и сопоставлены с эталонным геномом аденовируса 5 человека (AC_000008.1), полученным из NCBI с использованием STAR (73) с опцией -outFilterMismatchNoverLmax 0.3 (для учета повреждения РНК, вызванного высокой дозой УФ-излучения). ). Последующий анализ проводился с использованием только однозначно отображенных чтений. Фильтрация областей, охватываемых библиотеками PKR и GFP HITS-CLIP, была выполнена с использованием BEDTools с опцией пересечения.Специфические считывания PKR HITS-CLIP были визуализированы с помощью Integrative Genomics Viewer (IGV) (74).

Сшивка димеров или олигомеров ASC

Олигомеры

ASC были очищены, как сообщалось ранее (75). Вкратце, 15 × 10 ⁶ клеток THP-1, стабильно экспрессирующих YFP-ASC, инфицировали указанным аденовирусом. При 48 hpi NLRP3 активировали, как описано, и затем клетки инкубировали на льду в течение 30 минут в буфере A (20 мМ HEPES-KOH, pH 7,5, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA. по одной таблетке каждого / 10 мл лизирующего буфера полного коктейля с ингибитором протеазы, не содержащим ЭДТА (Sigma-Aldrich) и ингибитора фосфатазы PhosSTOP (Sigma-Aldrich).Лизис завершали 30-кратным разрезанием иглой 21-го размера, и лизаты очищали центрифугированием в течение 8 мин при 1800 × g , 4 ° C. Супернатанты разбавляли в соотношении 1: 1 буфером A и еще раз очищали центрифугированием при 2,000 × g в течение 5 минут при 4 ° C. Супернатанты разбавляли 1 объемом буфера CHAPS и олигомеры ASC осаждали центрифугированием при 5000 × g в течение 8 мин. Осадки ресуспендировали в 50 мкл буфера CHAPS, содержащего 4 мМ дисукцинимидилового суберата (растворенного в ДМСО), и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре для сшивания белков.После заключительного центрифугирования при 5000 × g в течение 8 минут при 4 ° C осадки ресуспендировали в 20 мкл 2-кратного белкового буфера для загрузки, кипятили в течение 5 минут при 100 ° C и загружали в готовые протеиновые гели (Any kD ™ Mini-PROTEAN ^® TGX ™, CA № 4569036). ASC детектировали вестерн-блоттингом с использованием анти-GFP-специфических антител (Abcam — ab290), как описано выше.

In vitro Транскрипция генов WT и мутантной VA RNAI

Матрицей для транскрипции in vitro генов VA РНК были продукты ПЦР, полученные с использованием прямого праймера (содержащего последовательность промотора Т7, выделенную жирным шрифтом) ATAATACGACTCACTATAG GGATGGAATTGTGGTCTGGTG и обратный праймер AAAAGGTCTCTGGAATTCAGAG). Транскрипция in vitro была выполнена с использованием набора для транскрипции TranscriptAid T7 High Yield (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. РНК очищали одним циклом экстракции фенолом и осаждения этанолом. РНК растворяли в стерильной H ₂ O и хранили при -80 ° C.

Анализ люциферазы

выполняли с помощью репортерной системы анализа люциферазы Nano-Glo ^® (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.Активность как люциферазы светлячков, так и активности нано-люциферазы измеряли на люминометре Infinite M200 (Tecan), и активность светлячков нормализовали по активности нано-активности и представляли как средние значения по меньшей мере из трех биологических повторов. Статистический анализ выполняли на Prism6 (GraphPad Software, США) с использованием двустороннего непарного теста t . Статистически значимым считалось значение p <0,05.

Коиммунопрециптация

Клетки

HEK293, стабильно экспрессирующие YFP-ASC и с интактной передачей сигналов TLR4 / MyD88, высевали из расчета 5 × 10 ⁵ клеток / лунку в шестилуночные планшеты.Клетки трансфицировали плазмидами, экспрессирующими PKR с меткой Flag (клон PKR cDNA ORF, человеческий, метка N-DDK (Flag), BioSite CA HG10080-NF) и NLRP3 с меткой GFP (pEGFP-C2-NLRP3, адген CA 73955). Клетки лизировали в буфере для лизиса (20 мМ Tris HCl pH 8, 137 мМ NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 мМ EDTA). Десять микролитров агарозы, конъюгированной против FLAG-M2 (Sigma), предварительно инкубировали с 5% BSA в PBS для минимизации неспецифического взаимодействия перед добавлением к 100 мкл клеточного лизата в 500 мкл раствора IB [5 мМ Tris -Cl, 10 мМ HEPES, pH 7.5, 10% глицерин, 50 мМ KCl, 0,05% Тритон X-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 1 × полный ингибитор протеазы (Roche Diagnostics)]. Инкубацию проводили при 4 ° C с осторожным вращением в течение ночи, после чего шарики собирали, трижды промывали 500 мкл раствора IB в течение 10 минут каждый. Гранулы ресуспендировали в 30 мкл буфера для образцов 2X SDS, кипятили, после чего 20 мкл элюатов подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител, описанных выше.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с помощью Prism Version 5.01 (программное обеспечение GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния). Параметрические тесты использовались для сравнения различных обработок с непарным t -тестом. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка, и различия считались значимыми, как указано ниже: ^* p <0,05; ^** p <0,01; ^*** p <0,001; ^**** p <0,001; нс: не имеет значения.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью / дополнительные материалы.

Взносы авторов

MD, GA и CS разработали эксперименты, интерпретировали данные, создали модели и написали статью. MG предоставила материал и критически рассмотрела статью. MD и WK провели эксперименты и предоставили материалы.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами GA от Шведского онкологического общества, https://www.cancerfonden.se/om-cancerfonden/about-the-swedish-cancer-society (номера грантов 170170 и 180599).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Анетт Карлссон за отличную техническую поддержку и Микаэля Селлина за конструктивные обсуждения.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.02791/full#supplementary-material

Дополнительная фигура 1. Анализ HITS-CLIP идентификация областей в VA РНК, защищенных взаимодействием с PKR. (A) Количество считываемых последовательностей РНК в VA RNAI и VA RNAII, специфически совместно преципитированных анти-PKR и сопоставленных с эталонным геномом Ad5 (AC_000008.1; NCBI). (B) Геномное расположение генов VA РНК. (C) Расположение идентифицированных считываний во вторичной структуре генов VA РНК показано красным. Нуклеотиды, выделенные жирным шрифтом в VA RNAI, обозначают преобладающие чтения в апикальной области. Нуклеотиды, выделенные жирным черным шрифтом в обеих VA РНК, показывают расположение пар тетрануклеотидных оснований.

Список литературы

1. Пунга Т., Камель В., Акусярви Г. Старые и новые функции РНК, ассоциированной с аденовирусным вирусом. Fut Virol. (2013) 8: 343–56. DOI: 10.2217 / fvl.13.19

CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Кларк PA, Pe’ery T., Ma Y, Mathews MB. Структурные особенности РНК, ассоциированной с вирусом аденовируса 2, необходимой для связывания с протеинкиназой DAI. Nucleic Acids Res . (1994) 22: 4364–74. DOI: 10.1093 / nar / 22.21.4364