Профессор лабораторной медицины и патологии
Профессор микробиологии
Отделение микробиологии
Клиника Мэйо, Рочестер, Миннесота

Здравствуйте, я доктор Нэнси Венгенак, я директор лаборатории микологии и микобактериологии в отделении клинической микробиологии клиники Майо в Рочестере, Миннесота.

Сегодняшняя презентация «Горячая тема» предназначена для тех, кто рассматривает возможность проведения тестирования дрожжей на чувствительность в своей лаборатории, возможно, впервые, или для тех, кто решил отправить свои изоляты дрожжей в референс-лабораторию для тестирования чувствительности, но хочет чтобы понять, как референс-лаборатория генерирует данные, которые возвращаются к ним в отчетах о чувствительности.

У меня нет информации, относящейся к этой «горячей теме».

В сегодняшней «Горячей теме» я рассмотрю наиболее распространенные методы, используемые клиническими лабораториями для тестирования чувствительности к противогрибковым препаратам изолятов дрожжей, выращенных из микробиологических культур. Кроме того, я расскажу, как устанавливаются пограничные значения, и выделю противогрибковые препараты, для которых в настоящее время доступны стандартизированные критерии интерпретации и пограничные значения. Наконец, мы рассмотрим значение, известное как эпидемиологическое пороговое значение, или ECV, и я расскажу, как устанавливаются значения ECV, для каких дрожжей они доступны в настоящее время, и я расскажу, как следует использовать ECV.

Итак, когда я должен заказать тест на чувствительность дрожжей, выделенных в культуре? Тестирование чувствительности изолятов дрожжей к противогрибковым препаратам важно, чтобы помочь клиницистам в выборе противогрибковых препаратов, которые могут быть полезны при лечении клинически значимого заболевания. Однако это не означает, что тестирование на чувствительность следует проводить для каждого изолята дрожжей, выделенного из культуры в лаборатории клинической микробиологии. Тестирование на чувствительность следует проводить, если изолят считается клинически значимым для врачей, ухаживающих за пациентом. Изоляты культур дрожжей из обычно стерильных источников, таких как кровь или спинномозговая жидкость, почти всегда считаются значимыми, и следует проводить тестирование на чувствительность. Однако не все дрожжевые грибки, извлеченные из нестерильного источника, такого как мокрота, мазок изо рта или с кожи, являются клинически значимыми, и проведение тестирования на чувствительность этих изолятов может быть пустой тратой ограниченных ресурсов.

Кроме того, следует подумать о том, будет ли результат теста на восприимчивость действенным. Как мы обсудим в этой «Актуальной теме», эталонный метод и критерии интерпретации предназначены для наиболее часто встречающихся дрожжевых грибков, а именно для некоторых видов Candida и видов Cryptococcus . Тестирование чувствительности других родов или других видов приведет к сообщению о минимальных ингибирующих концентрациях или МИК без сопутствующих интерпретирующих критериев, таких как «чувствительный» или «устойчивый». Отсутствие четких интерпретационных критериев затрудняет использование результатов определения чувствительности к противогрибковым препаратам для врачей. Ваша группа по инфекционным заболеваниям или группа по управлению противомикробными препаратами могут помочь разработать рекомендации для вашей лаборатории о том, когда проводить тестирование чувствительности дрожжей.

После принятия решения о проведении теста на чувствительность к противогрибковым препаратам существуют как минимум две крупные международные организации, которые предоставляют клиническим лабораториям рекомендации по проведению стандартизированного тестирования чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам. Этими двумя организациями являются Европейский комитет по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам (или EUCAST) и Институт клинических и лабораторных стандартов (также известный как CLSI). Многие рекомендации двух групп согласованы, но существуют некоторые различия. В этой «актуальной теме» я сосредоточусь на методе CLSI и критериях интерпретации, но я рекомендую вам также посетить веб-сайт EUCAST по адресу www.eucast.org для получения дополнительной информации об их стандартах.

Хорошо. Итак, давайте немного поговорим о различных методах, которые можно использовать для тестирования чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам. Тестирование чувствительности к противогрибковым препаратам можно проводить с использованием фенотипических или генотипических методов. Генотипические методы, такие как таргетная ПЦР или секвенирование ДНК, используются для некоторых комбинаций грибов и противогрибковых препаратов, таких как исследование fks, гена глюкансинтазы, мутаций очага, которые вызывают резистентность к эхинокандину у Виды Candida . Тем не менее, генотипические методы прогнозирования восприимчивости дрожжей не стандартизированы и по-прежнему в значительной степени используются в исследовательских лабораториях или лабораториях общественного здравоохранения.

Большинство клинических лабораторий в настоящее время используют фенотипические методы для тестирования противогрибковой чувствительности, и существует ряд различных фенотипических методов, которые можно использовать. Принятым эталонным методом является тестирование разбавления бульона, и этот метод признан эталонным как EUCAST, так и CLSI. Вместо эталонного метода многие больничные лаборатории могут выбрать метод микробульонного разведения с колориметрической конечной точкой, такой как обеспечиваемый планшетами YeastOne Sensititre от ThermoFisher, или они могут выбрать использование автоматического прибора для микробульонного разведения, такого как Vitek от bioMérieux. Часто выбирают эти альтернативные методы, потому что панели чувствительности имеются в продаже, что делает их удобными для занятых лабораторий, которые предпочитают покупать, а не изготавливать панели для разбавления бульона самостоятельно. Наконец, метод дисковой диффузии или градиентные полоски МИК, такие как Е-тестовые полоски или градиентные полоски от Lilofilchem, также коммерчески доступны и используются в некоторых лабораториях.

Если вы намереваетесь провести тестирование чувствительности дрожжей в своей лаборатории с использованием метода разбавления в бульоне, есть два документа CLSI, в которых содержится очень полезная информация. . Документ CLSI M27 обеспечивает методологическую основу для выполнения метода разбавления эталонного бульона. M27 охватывает выбор и приготовление противогрибковых средств, необходимые процедуры контроля качества, а также подробно описывает, как выполнять саму процедуру тестирования. Сопутствующий документ M60 содержит таблицы со стандартными контрольными точками и критериями интерпретации, доступными для дрожжей. Я полагаю, что документ M60 будет перенумерован в ближайшем будущем и опубликован в качестве дополнения к документу M27, поэтому, пожалуйста, следите за изменением нумерации этого документа, когда это произойдет. Документ о контрольных точках и критериях интерпретации ежегодно обновляется CLSI по мере поступления новых данных. Документ по эталонному методу требует менее частых пересмотров и поэтому обновляется каждые три года или около того, в зависимости от изменений в данной области.

Документ M27 предназначен для предоставления методологии тестирования чувствительности видов Candida и видов Cryptococcus , но он еще не прошел проверку для использования с другими родами дрожжей или с дрожжевыми формами эндемичных диморфных патогенов, таких как Histoplasma capsulatum или Blastomyces dermatitidis . Этот метод также не предназначен для использования с нитчатыми плесневыми грибами, такими как виды Aspergillus , и существует отдельный стандарт CLSI для тестирования восприимчивости к плесени, документ CLSI M38.

Как я уже упоминал, признанным эталонным методом тестирования дрожжей на чувствительность к противогрибковым препаратам является разбавление в бульоне. Этот метод был разработан и согласован в рамках международного процесса консенсуса, в котором использовались знания и опыт экспертов по микологии в больничных лабораториях клинической микробиологии и государственных учреждений, таких как CDC, FDA и Служба общественного здравоохранения Канады, а также экспертов из фармацевтическая промышленность и производители устройств. Использование эталонного метода значительно облегчает межлабораторное согласование при тестировании дрожжей на устойчивость к противогрибковым препаратам и улучшает уход за пациентами, обеспечивая надежные результаты определения чувствительности независимо от географического положения пациента. Как уже упоминалось, эталонным методом является разбавление в бульоне, но может быть выполнено либо макробульон, либо микробульон, и могут быть получены эквивалентные результаты независимо от того, какой формат выбран.

Многие лаборатории предпочитают проводить тестирование дрожжей в разведении в микробульоне, а не в разведении в макробульоне, потому что метод разведения в микробульоне можно проводить в титрационных микропланшетах, что экономит затраты на реагенты и пространство в инкубаторе. Кроме того, как уже упоминалось, планшеты для разбавления микробульона коммерчески доступны. Для выполнения метода микробульонных разведений изолят тестируемых дрожжей должен быть выбран из чашки с агаром, содержащей чистую культуру микроорганизма. Необходимо следить за тем, чтобы смеси дрожжей или дрожжей, смешанных с бактериями, не тестировались, так как результат МПК, полученный для смеси, может быть неточным. Готовят стандартизированную суспензию дрожжей в стерильном физиологическом растворе или стерильной воде до концентрации, эквивалентной 0,5 стандарта МакФарланда. Из него готовят рабочий инокулят путем разбавления суспензии дрожжей бульоном RPMI до конечной стандартизованной концентрации. Затем инокулят добавляют в каждую лунку титрационного микропланшета, чаще всего с использованием повторяющегося или многоканального пипеточного дозатора. Планшет для микротитрования уже содержит тестируемые противогрибковые препараты, часто поставляемые в лиофилизированном или замороженном виде, и противогрибковые препараты распределяются на планшете рядами, при этом концентрация противогрибкового препарата увеличивается за счет удвоения разведения в градиенте поперек планшета или иногда вниз по поверхности планшета. колонка в зависимости от компоновки плиты. После инокуляции тестируемым изолятом дрожжей планшет закрывают и инкубируют при 35°C в течение от 24 до 48 часов при тестировании Виды Candida . Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii обычно растут медленнее, поэтому для Cryptococcus видов может потребоваться инкубация до 72 часов.

После инкубации в течение необходимого периода панель можно считать либо вручную с помощью световой камеры, либо с помощью полуавтоматического планшетного ридера. Конечную точку определяют путем сравнения роста в каждой лунке по сравнению с контрольной лункой. Для эталонного метода разбавления бульона минимальная ингибирующая концентрация, или МИК, представляет собой наименьшую концентрацию противогрибкового амфотерицина В, предотвращающую рост дрожжей, или наименьшую концентрацию лекарственного средства, вызывающую 50-процентное снижение роста, что визуализируется заметным снижение мутности азолов, эхинокандинов и флуцитозина.

Коммерческие панели для разведения микробульона, такие как показанный на этом слайде, имеют колориметрический индикатор, который помогает определить конечную точку, и некоторые люди считают, что эти конечные точки легче читать, поскольку изменение цвета соответствует требуемому снижению роста. для каждого класса наркотиков с использованием эталонного метода. Это устраняет необходимость в том, чтобы персонал лаборатории определял уровень снижения роста на 50%, что может быть сложно для неопытного читателя. Синий цвет указывает на отсутствие роста, а розовый или фиолетовый цвет указывает на рост изолята дрожжей в этой лунке микротитровального устройства. Лунка в положении A1 в верхнем левом углу представляет собой лунку с положительным контролем роста, и эта лунка имеет розовато-фиолетовый цвет, что указывает на достаточный рост контрольного организма, поэтому планшет готов к считыванию. Эхинокандиновые препараты (анидулафунгин, микафунгин и каспофунгин) показаны в трех верхних рядах, конечная точка для каждого препарата обведена кружком. Для анидулафунгина конечная точка составляет 0,03 мкг/мл; для микафунгина конечная точка составляет 0,008 мкг/мл; а для каспофунгина конечная точка читается как 0,12 мкг/мл. Что касается эхинокандинов, то в некоторых источниках предполагается, что тестирование чувствительности к каспофунгину in vitro может быть технически сложным и что результаты не всегда коррелируют с активностью препарата in vivo. Поэтому некоторые эксперты рекомендуют использовать результаты тестирования на чувствительность к анидулафунгину или микафунгину в качестве заменителей эхинокандинов. Это все еще находится в стадии изучения, и это не означает, что каспофунгин не следует применять в клинике по показаниям; это просто означает, что лабораторные испытания каспофунгина in vitro могут не отражать его применимость in vivo.

Глядя на другие препараты на планшете, конечная точка для 5-флуцитозина в ряду D составляет 0,06 мкг/мл; позаконазол в ряду E имеет конечную точку 0,5 мкг/мл; вориконазол в строке F имеет МИК 0,12 мкг/мл; итраконазол в ряду G имеет МИК 0,25 мкг/мл; а флуконазол в строке H имеет МИК 8 мкг/мл. Амфотерицин В ориентирован сверху вниз на планшете в колонке 12, и его конечная точка составляет 0,5 мкг/мл. Принятая воспроизводимость метода разбавления бульона составляет плюс-минус одно 2-кратное или двукратное разведение. Итак, что это означает в практическом плане? Если мы используем вориконазол и итраконазол в качестве примера, МПК вориконазола читается как 0,12 мкг/мл. Если бы мы провели повторное тестирование во второй раз, результат МИК для второго теста мог бы составить 0,06, 0,12 или 0,25 мкг/мл, и они были бы практически такими же, как мы получили для первого теста, поскольку присущая тесту вариабельность положительная. или минус 1 двукратное разведение. Кроме того, если мы сравним МИК вориконазола и МИК итраконазола, то увидим, что они находятся в пределах плюс-минус 1 двойного разведения друг от друга при 0,12 мкг/мл и 0,25 мкг/мл, поэтому оба препарата можно рассматривать как имеющие практически эквивалентную конечную точку. Наличие более низкой МПК при 1-кратном разведении не означает, что в этом примере вориконазол будет лучшим выбором, чем итраконазол. Другие факторы, которые мы обсудим в дополнение к MIC, играют важную роль в выборе противогрибкового препарата для клинического применения. Наконец, важно помнить, что дрожжи должны быть полностью идентифицированы до видового уровня, чтобы выбрать правильные пограничные значения и критерии интерпретации. Мы также рассмотрим это более подробно на следующих слайдах.

В настоящее время для всех противогрибковых препаратов или для всех видов Candida , специфические для видов пограничные значения и критерии интерпретации недоступны. На момент написания этой записи контрольные точки доступны для эхинокандинов (а именно, каспофунгина, микафунгина и анидулафунгина) и двух азолов (флуконазола и вориконазола). Для этих пяти препаратов доступны видовые пограничные значения для шести различных Candida 9.0005 видов, которые составляют Candida Albicans , Candida Glabrata (также известный под новым названием Nakaseomyces glabrata ), Candida Tropicalis , Candida Krusei (также имеет новое имя в качестве Pichia . ), Candida parapsilosis и Candida guilliermondii . Контрольные точки для конкретных видов недоступны для других видов Candida или других дрожжей, включая Cryptococcus 9.0005  виды. Для видов Candida без установленных пограничных значений и для Cryptococcus видов лаборатории должны сообщать значение МИК только без интерпретации и могут рассмотреть возможность добавления комментария к отчету, который указывает что-то вроде «для этого препарата нет стандартных интерпретационных критериев». ». Критерии интерпретации для дополнительных родов и видов дрожжей и для дополнительных противогрибковых препаратов будут добавлены в документ M60 по мере их поступления от Подкомитета по тестированию чувствительности к противогрибковым препаратам CLSI. Эта группа регулярно собирается для рассмотрения новых данных по мере их поступления и для установления дополнительных контрольных точек для документа M60 по конкретным видам.