тип отчет об исключении

сообщение javax.servlet.jsp.JspTagException: ресурс не найден (/_ui/desktop/common/np/css/bootstrap.css)

описание Сервер обнаружил внутреннюю ошибку, которая не позволила ему выполнить этот запрос.

исключение

 javax.servlet.ServletException: javax.servlet.jsp.JspTagException: ресурс не найден (/_ui/desktop/common/np/css/bootstrap.css)
org.apache.jasper.runtime.PageContextImpl.doHandlePageException(PageContextImpl.ява: 916)
org.apache.jasper.runtime.PageContextImpl.handlePageException(PageContextImpl.java:845)
org.apache.jsp.WEB_002dINF.views.desktop.pages.layout.static_jsp._jspService(static_jsp.java:123)
org.apache.jasper.runtime.HttpJspBase.service(HttpJspBase.java:70)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:727)
org.apache.jasper. servlet.JspServletWrapper.service(JspServletWrapper.java:432)
org.apache.jasper.servlet.JspServlet.serviceJspFile(JspServlet.java:395)
орг.apache.jasper.servlet.JspServlet.service(JspServlet.java:339)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:727)
org.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:52)
sun.reflect.GeneratedMethodAccessor1424.invoke (неизвестный источник)
sun.reflect.DelegatingMethodAccessorImpl.invoke(DelegatingMethodAccessorImpl.java:43)
java.lang.reflect.Method.invoke(Method.java:497)
net.bull.javamelody.JspWrapper.invoke(JspWrapper.java:150)
net.bull.javamelody.JdbcWrapper$DelegatingInvocationHandler.вызвать (JdbcWrapper.java: 286)
com.sun.proxy.$Proxy195.forward(Неизвестный источник)
org.springframework.web.servlet.view.InternalResourceView.renderMergedOutputModel(InternalResourceView.java:168)
org.springframework.web.servlet.view.AbstractView.render(AbstractView.java:303)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.render(DispatcherServlet. java:1257)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.processDispatchResult (DispatcherServlet.java:1037)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doDispatch(DispatcherServlet.java:980)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doService(DispatcherServlet.java:897)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.processRequest(FrameworkServlet.java:970)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.doGet(FrameworkServlet.java:861)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:620)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.service(FrameworkServlet.java:846)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.ява: 727)
org.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:52)
sun.reflect.GeneratedMethodAccessor1424.invoke (неизвестный источник)
sun.reflect.DelegatingMethodAccessorImpl.invoke(DelegatingMethodAccessorImpl.java:43)
java.lang.reflect.Method.invoke(Method.java:497)
net.bull.javamelody.JspWrapper.invoke(JspWrapper.java:150)
net. bull.javamelody.JdbcWrapper$DelegatingInvocationHandler.invoke(JdbcWrapper.java:286)
com.sun.proxy.$Proxy195.forward(Неизвестный источник)
com.newport.genesis.storefront.filters.RedirectFilter.doFilter(RedirectFilter.java:245)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.CartRestorationFilter.doFilterInternal(CartRestorationFilter.java:123)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.ява: 225)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:317)
org.springframework.security.web.access.intercept.FilterSecurityInterceptor.invoke(FilterSecurityInterceptor.java:127)
org.springframework.security.web.access.intercept.FilterSecurityInterceptor.doFilter(FilterSecurityInterceptor. java:91)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.access.ExceptionTranslationFilter.doFilter(ExceptionTranslationFilter.java:115)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.session.SessionManagementFilter.doFilter(SessionManagementFilter.java:137)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.AnonymousAuthenticationFilter.doFilter(AnonymousAuthenticationFilter.ява:111)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.rememberme.RememberMeAuthenticationFilter.doFilter(RememberMeAuthenticationFilter.java:150)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy. java:331)
org.springframework.security.web.servletapi.SecurityContextHolderAwareRequestFilter.doFilter(SecurityContextHolderAwareRequestFilter.java:169)
орг.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.savedrequest.RequestCacheAwareFilter.doFilter(RequestCacheAwareFilter.java:63)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.AbstractAuthenticationProcessingFilter.doFilter(AbstractAuthenticationProcessingFilter.java:200)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.logout.LogoutFilter.doFilter(LogoutFilter.java:121)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.header.HeaderWriterFilter.doFilterInternal (HeaderWriterFilter. java:66)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.context.request.async.WebAsyncManagerIntegrationFilter.doFilterInternal(WebAsyncManagerIntegrationFilter.java:56)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.context.SecurityContextPersistenceFilter.doFilter(SecurityContextPersistenceFilter.java:105)
орг.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.access.channel.ChannelProcessingFilter.doFilter(ChannelProcessingFilter.java:157)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org. springframework.security.web.FilterChainProxy.doFilterInternal (FilterChainProxy.java:214)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy.doFilter(FilterChainProxy.java:177)
де.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.UrlEncoderFilter.doFilterInternal(UrlEncoderFilter.java:72)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.StorefrontFilter.doFilter(StorefrontFilter.java:99)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.cms.CMSSiteFilter.doFilterInternal(CMSSiteFilter.java:100)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter. doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
ком.ньюпорт.genesis.storefront.filters.RequestLoggerFilter.doFilter(RequestLoggerFilter.java:89)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.AcceleratorAddOnFilter.doFilter(AcceleratorAddOnFilter.java:92)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
de.hybris.platform.servicelayer.web.SessionFilter.doFilter(SessionFilter.java:96)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
de.hybris.platform.servicelayer.web.Log4JFilter.doFilter(Log4JFilter.java:44)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain. doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain.doFilterInternal(AbstractPlatformFilterChain.java:155)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.invokeDelegate(DelegatingFilterProxy.java:346)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.doFilter(DelegatingFilterProxy.java:262)
org.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:52)
net.bull.javamelody.MonitoringFilter.doFilter(MonitoringFilter.java:201)
net.bull.javamelody.MonitoringFilter.doFilter(MonitoringFilter.java:178)
org.springframework.web.filter.CharacterEncodingFilter.doFilterInternal (CharacterEncodingFilter.java:197)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
com.newport.genesis.storefront.filters.AcceleratorAddOnFilter.doFilter(AcceleratorAddOnFilter.java:92)
org.springframework.web.filter. DelegatingFilterProxy.invokeDelegate(DelegatingFilterProxy.java:346)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.doFilter(DelegatingFilterProxy.java:262)
de.hybris.platform.servicelayer.web.XSSFilter.processPatternsAndDoFilter(XSSFilter.java:342)
de.hybris.platform.servicelayer.web.XSSFilter.doFilter(XSSFilter.java:290)
 

основная причина

 javax.servlet.jsp.JspTagException: ресурс не найден (/_ui/desktop/common/np/css/bootstrap.css)
net.sf.packtag.tag.BaseTag.promoteError(BaseTag.java:298)
net.sf.packtag.tag.PackTag.doEndTag(PackTag.java:67)
org.apache.jsp.tag.webdesktop.template.styleSheets_tag._jspx_meth_pack_005fstyle_005f0(styleSheets_tag.ява: 246)
org.apache.jsp.tag.webdesktop.template.styleSheets_tag.doTag(styleSheets_tag.java:86)
org.apache.jsp.tag.webdesktop.template.master_tag._jspx_meth_template_005fstyleSheets_005f0(master_tag.java:1631)
org.apache.jsp.tag.webdesktop.template.master_tag.doTag(master_tag.java:283)
org.apache.jsp.tag.webdesktop. template.page_tag._jspx_meth_template_005fmaster_005f0(page_tag.java:203)
org.apache.jsp.tag.webdesktop.template.page_tag.doTag(page_tag.java:166)
org.apache.jsp.WEB_002dINF.представления.desktop.pages.layout.static_jsp._jspx_meth_template_005fpage_005f0(static_jsp.java:142)
org.apache.jsp.WEB_002dINF.views.desktop.pages.layout.static_jsp._jspService(static_jsp.java:110)
org.apache.jasper.runtime.HttpJspBase.service(HttpJspBase.java:70)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:727)
org.apache.jasper.servlet.JspServletWrapper.service(JspServletWrapper.java:432)
org.apache.jasper.servlet.JspServlet.serviceJspFile(JspServlet.java:395)
org.apache.jasper.servlet.JspServlet.сервис (JspServlet.java:339)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:727)
org.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:52)
sun.reflect.GeneratedMethodAccessor1424.invoke (неизвестный источник)
sun.reflect.DelegatingMethodAccessorImpl.invoke(DelegatingMethodAccessorImpl.java:43)
java. lang.reflect.Method.invoke(Method.java:497)
net.bull.javamelody.JspWrapper.invoke(JspWrapper.java:150)
net.bull.javamelody.JdbcWrapper$DelegatingInvocationHandler.invoke(JdbcWrapper.ява: 286)
com.sun.proxy.$Proxy195.forward(Неизвестный источник)
org.springframework.web.servlet.view.InternalResourceView.renderMergedOutputModel(InternalResourceView.java:168)
org.springframework.web.servlet.view.AbstractView.render(AbstractView.java:303)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.render(DispatcherServlet.java:1257)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.processDispatchResult (DispatcherServlet.java:1037)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doDispatch(DispatcherServlet.ява: 980)
org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doService(DispatcherServlet.java:897)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.processRequest(FrameworkServlet.java:970)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.doGet(FrameworkServlet.java:861)
javax.servlet.http.HttpServlet. service(HttpServlet.java:620)
org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.service(FrameworkServlet.java:846)
javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:727)
орг.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:52)
sun.reflect.GeneratedMethodAccessor1424.invoke (неизвестный источник)
sun.reflect.DelegatingMethodAccessorImpl.invoke(DelegatingMethodAccessorImpl.java:43)
java.lang.reflect.Method.invoke(Method.java:497)
net.bull.javamelody.JspWrapper.invoke(JspWrapper.java:150)
net.bull.javamelody.JdbcWrapper$DelegatingInvocationHandler.invoke(JdbcWrapper.java:286)
com.sun.proxy.$Proxy195.forward(Неизвестный источник)
com.newport.genesis.storefront.filters.RedirectFilter.doFilter(RedirectFilter.java:245)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.CartRestorationFilter.doFilterInternal(CartRestorationFilter.java:123)
org.springframework. web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
орг.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:317)
org.springframework.security.web.access.intercept.FilterSecurityInterceptor.invoke(FilterSecurityInterceptor.java:127)
org.springframework.security.web.access.intercept.FilterSecurityInterceptor.doFilter(FilterSecurityInterceptor.java:91)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.access.ExceptionTranslationFilter.doFilter(ExceptionTranslationFilter.java:115)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.session.SessionManagementFilter.doFilter(SessionManagementFilter.java:137)
org.springframework.security. web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.AnonymousAuthenticationFilter.doFilter(AnonymousAuthenticationFilter.java:111)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.rememberme.RememberMeAuthenticationFilter.doFilter(RememberMeAuthenticationFilter.java:150)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.servletapi.SecurityContextHolderAwareRequestFilter.doFilter(SecurityContextHolderAwareRequestFilter.java:169)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.savedrequest.RequestCacheAwareFilter.doFilter(RequestCacheAwareFilter.java:63)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy. java:331)
org.springframework.security.web.authentication.AbstractAuthenticationProcessingFilter.doFilter(AbstractAuthenticationProcessingFilter.java:200)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.authentication.logout.LogoutFilter.doFilter(LogoutFilter.java:121)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.header.HeaderWriterFilter.doFilterInternal (HeaderWriterFilter.java:66)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.context.request.async.WebAsyncManagerIntegrationFilter.doFilterInternal(WebAsyncManagerIntegrationFilter.java:56)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
org. springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.context.SecurityContextPersistenceFilter.doFilter(SecurityContextPersistenceFilter.java:105)
орг.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.access.channel.ChannelProcessingFilter.doFilter(ChannelProcessingFilter.java:157)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy$VirtualFilterChain.doFilter(FilterChainProxy.java:331)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy.doFilterInternal (FilterChainProxy.java:214)
org.springframework.security.web.FilterChainProxy.doFilter(FilterChainProxy.java:177)
де.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.UrlEncoderFilter.doFilterInternal(UrlEncoderFilter.java:72)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter. doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.StorefrontFilter.doFilter(StorefrontFilter.java:99)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.cms.CMSSiteFilter.doFilterInternal(CMSSiteFilter.java:100)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
ком.ньюпорт.genesis.storefront.filters.RequestLoggerFilter.doFilter(RequestLoggerFilter.java:89)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
com.newport.genesis.storefront.filters.AcceleratorAddOnFilter. doFilter(AcceleratorAddOnFilter.java:92)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
de.hybris.platform.servicelayer.web.SessionFilter.doFilter(SessionFilter.java:96)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
de.hybris.platform.servicelayer.web.Log4JFilter.doFilter(Log4JFilter.java:44)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain$InternalFilterChain.doFilter(AbstractPlatformFilterChain.java:225)
de.hybris.platform.servicelayer.web.AbstractPlatformFilterChain.doFilterInternal(AbstractPlatformFilterChain.java:155)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.invokeDelegate(DelegatingFilterProxy.java:346)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.doFilter(DelegatingFilterProxy.java:262)
org. apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:52)
net.bull.javamelody.MonitoringFilter.doFilter(MonitoringFilter.java:201)
net.bull.javamelody.MonitoringFilter.doFilter(MonitoringFilter.java:178)
org.springframework.web.filter.CharacterEncodingFilter.doFilterInternal (CharacterEncodingFilter.java:197)
org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107)
com.newport.genesis.storefront.filters.AcceleratorAddOnFilter.doFilter(AcceleratorAddOnFilter.java:92)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.invokeDelegate(DelegatingFilterProxy.java:346)
org.springframework.web.filter.DelegatingFilterProxy.doFilter(DelegatingFilterProxy.java:262)
de.hybris.platform.servicelayer.web.XSSFilter.processPatternsAndDoFilter(XSSFilter.java:342)
de.hybris.platform.servicelayer.web.XSSFilter.doFilter(XSSFilter.java:290)
 

note Полная трассировка стека основной причины доступна в журналах Apache Tomcat/7.0.59.

Apache Tomcat/7.

Документ без названия

Перед использованием MEF для культуры ES вы должны размножить и инактивировать (остановить клеточное деление) MEF, чтобы сделать фидеры.

Расширение MEF
День 1:   Разморозить 1 флакон MEF на чашку 10 см. Используйте питательные среды для культуры. Эти клетки не нужно кормить каждый день, но можно кормить каждые 2 дня.
День 2-3:  При сливном пассаже каждые 10 см планшета 1:3. (3 чашки по 10 см)
День 4-5:   При конфлюэнтном пассаже каждая чашка 10 см на чашку 120 см 1:1 или каждая чашка 10 см на чашку 3-10 см (1:3).
День 5–6: При слиянии инактивировать MEF и заморозить.

Инактивация MEF
Мы используем Митомиоцин С для инактивации. Он доступен от Sigma (M-0503) 2 мг/флакон в виде порошка
. ВАЖНОЕ ПРИМЕЧАНИЕ. Митомиоцин С токсичен, не допускать попадания на кожу

1. Приготовьте свежий раствор митомиоцина С. Используйте шприц на 5 мл и введите 2 мл PBS в бутылку, чтобы получить 1 мг/мл. Хорошо перемешайте и наберите обратно в шприц. Пропустите через шприцевой фильтр 0,2 мкм и поместите в пробирку на 15 мл. Завернуть в алюминиевую фольгу и хранить при 4°С.
2.   Разбавьте 1:100 фидерной средой, когда будете готовы инактивировать MEF. Вам понадобится 5 мл. сред с лекарственными средствами на каждую чашку 10 см и 15 мл среды на чашку 120 см. Для 9 чашек размером 120 см вам потребуется 135 мл фидерной среды с добавлением 1,3 мл митомиоцина С в среду.
3.   Добавьте среду с митомиоцином С в чашки и инкубируйте при 37°С в течение 2–3 часов.
4.   Аспирируйте среду с митомиоцином С в колбу.
5.   Промойте PBS. Трипсинизируют в течение 5 мин при 37°С.
6. Инактивируйте трипсин с помощью питающей среды и соберите в пробирки на 50 мл.
7. Снова промыть планшеты PBS, чтобы увеличить выход клеток.
8.   Промойте клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.
9. Ресуспендируйте в 25 мл PBS. Сделайте 3 промывки PBS при объединении клеток в одну пробирку на 50 мл. Во время промывок (или раньше) замораживайте среду.
а. 20 % FBS, 20 % ДМСО, 60 % DMEM и
. б. 20% FBS, 80% DMEM
окончательное замораживание конц.будет 10% DMSO, 20% FBS, 70% DMEM
10. Подсчитайте клетки. Рассчитайте концентрацию флакона и количество, используя рабочий лист. т. е. 2,5 x 106 ячеек/чашка 10 см
11.   Промаркируйте соответствующие флаконы для замораживания объемом 2 мл (Corning) с указанием концентрации, даты и т. д. Поместите флаконы на лед с замораживающей средой и ослабьте крышки.
12. Ресуспендируйте клетки при удвоенной концентрации замораживания. в 20% FBS, 80% DMEM
т.е. 12 флаконов с 1X конц. добавить 6 мл 20% FBS, 80% DMEM
13.Добавьте равный объем среды для замораживания 20% FBS, 20% DMSO, 60% DMEM до объема. клеток. Хорошо смешать.
14. Аликвота 1 мл/флакон быстро. Только аликвоту 3-5 мл за один раз, чтобы предотвратить эффект потока. Затяните колпачки.
15.  Немедленно перенесите в морозильную камеру с температурой -80 C. Перенесите в резервуар с жидким азотом в течение одной недели.

Таблица размеров пластин и соответствующей концентрации дозатора

Размер                                         Дозатор Концентрация
тарелка 10 см                                 1X (две тарелки используют 2X
6-луночный планшет                                       концентрация)
24-луночный планшет
12-луночный планшет
96-луночный планшет                                                           
Тарелка 60 см                              .35X
2 лунки 6-луночного планшета
8 лунок 24-луночного планшета
2 4-луночных планшета nunc                                                 

Формы         Сервисы        Ссылки        Вернуться на главную страницу протокола        Вернуться на главную страницу ES Core

границ | Новая модель гематоэнцефалического барьера Transwell с использованием первичных клеток человека

Введение

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) представляет собой уникальный интерфейс, разделяющий периферическое кровоснабжение и нервную ткань. Структурно ГЭБ состоит из специализированных эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга (HBMEC), периваскулярных клеток (перицитов) и астроцитов (Abbott et al., 2006, 2010). Нейроны и микроглия также вносят вклад в поддержание ГЭБ и формируют то, что известно как нейроваскулярная единица (NVU) (Abbott et al., 2006). Перициты составляют 22–32% сосудов головного мозга и вместе с клетками гладкой мускулатуры сосудов и эндотелиальными клетками поддерживают сосудистую функцию (Martini and Bartholomew, 2017).В ЦНС перициты присутствуют в более высоком соотношении с HBMEC в головном мозге по сравнению с периферией, и недавние исследования показали обширную роль перицитов в развитии и поддержании ГЭБ (Kacem et al., 1998; Armulik et al., 2011; Суини и др., 2016). Помимо механической поддержки, они также регулируют сократимость сосудов, пролиферацию эндотелия, кровоток и ангиогенез (Bergers and Song, 2005; Dore-Duffy, 2008). Также было показано, что перициты секретируют ангиогенные факторы, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), которые поддерживают выживание и пролиферацию эндотелиальных клеток (Darland et al. , 2003). При таких патологиях, как ишемический инсульт, между соседними перицитами могут образовываться большие промежутки, увеличивающие проницаемость барьера и протечку сосудов. Эти изменения в морфологии перицитов в сочетании с усилением экспрессии молекул адгезии и лигандов лейкоцитарного интегрина способствуют экстравазации периферических лейкоцитов в головной мозг после ишемического инсульта (Pieper et al., 2013). Таким образом, перициты играют большую роль в функционировании сосудов головного мозга в нормальных физиологических условиях, а также в сосудистой дисфункции при гипоксии.

Несколько исследований также выявили роль нейронов и глии в развитии и поддержании ГЭБ. Нейральные клетки-предшественники, присутствующие в желудочковом нейроэпителии, как было показано, помогают рекрутированию эндотелиальных клеток во время раннего развития BBB, которое в значительной степени регулируется сигнальным путем Wnt (Risau et al., 1986). В частности, передача сигналов Wnt на раннем этапе развития ЦНС отвечает за стабилизацию сосудов и ангиогенез (Liebner et al. , 2008). В дополнение к этому было показано, что ранняя передача сигналов нейронами необходима для созревания ГЭБ, в частности, для организации плотных соединений (TJ).Исследование, проведенное с использованием эндотелиальных клеток микрососудов крысы и нейрональных клеток-предшественников, показало, что в присутствии нейральных клеток-предшественников эндотелиальные клетки установили регулярное образование TJ, включая: клаудин 5, zonula occludens (ZO-1) и окклюдин (Weidenfeller et al., 2007). После созревания поддержание ГЭБ и сохранение гомеостаза головного мозга в значительной степени зависит от адекватной перфузии нейронной ткани и передачи нейронами сигналов к сосудам головного мозга, процесс, известный как гиперемия (Attwell et al., 2010). Исследования показали, что перекрестные помехи между нейронами и астроцитами важны для соответствующей сократимости сосудов и кровотока в зависимости от метаболических потребностей (Zonta et al., 2003; Attwell et al., 2010; Macvicar and Newman, 2015). При церебральной ишемии астроциты ощущают повышение уровня ионов Ca ²⁺ и увеличение внеклеточного глутамата, высвобождаемого нейронами, и реагируют соответствующим образом, секретируя ряд вазоактивных веществ, помогающих смягчить последствия окклюзии кровеносных сосудов (Macvicar and Newman, 2015).В целом взаимодействия между нервными и сосудистыми клетками внутри NVU считаются первостепенными для функциональности ГЭБ, поскольку вместе они индуцируют и усиливают барьерные свойства; помогая сохранить его ключевые характеристики, включая низкую парацеллюлярную проницаемость и функциональную герметичность (Abbott et al., 2010). Разрушение ГЭБ при таких состояниях, как ишемический инсульт, может привести к серьезным последствиям для гомеостаза головного мозга, поэтому моделирование этих взаимодействий необходимо для понимания сложных сигнальных сетей между этими типами клеток и того, как на них влияют болезненные состояния.

На сегодняшний день разработан ряд моделей ГЭБ, начиная от монослоев HBMEC и заканчивая более сложными моделями в виде сфероидов и чипов, см. Таблицу 1. После успешного выделения эндотелиальных клеток головного мозга были разработаны первые, наиболее упрощенные модели ГЭБ с использованием HBMEC в качестве одиночный монослой на аблюминальной стороне трансвеллальных вставок, см. табл. 1 (Borges et al., 1994; Hartz et al., 2010). Позднее добавление других типов клеток ГЭБ (астроцитов и перицитов) привело к разработке трансвелловых систем совместного культивирования, которые демонстрировали большую прочность барьера, демонстрируемую более высокой трансэпителиальной резистентностью (TEER) и более низкой проницаемостью, чем отдельные модели HBMEC, см. Рисунок 1.В более поздних трансвелловых системах обычно используются три типа клеток, происходящих от крупного рогатого скота, свиней или грызунов, см. Таблицу 1 (Gaillard et al., 2000; Nakagawa et al., 2009; Thomsen et al., 2015).

Рис. 1. Схематическое изображение разработки модели ГЭБ. (A) Модель клеток совместного культивирования, содержащая HBMEC и астроциты. (B) HBMEC, посеянные на апикальной стороне, астроциты, посеянные на нижней стороне вставки, и перициты, посеянные на дне планшета. (C) HBMEC, высеянные на апикальную сторону вставки, перициты, высеянные на нижнюю сторону вставки, и астроциты, высеянные на дно планшета. (D) HBMEC, посеянные на апикальной стороне вставки со смешанной культурой астроцитов и перицитов на нижней стороне вставки. (E) HBMEC, посеянные на апикальной стороне вставки, со смешанной культурой астроцитов и перицитов на нижней стороне вставки и нейронами, посеянными на покровное стекло, покрытое поли-L-лизином, на дне планшета.

Таблица 1. Различные модели гематоэнцефалического барьера; Их особенности, преимущества и недостатки.

Хотя моделирование с использованием нечеловеческих клеток дешевле и проще в получении, они не сопоставимы с человеческими клетками, при этом многие исследования показывают ключевые различия в морфологии и функциях, особенно в их чувствительности к глутамату и экспрессии белков-переносчиков оттока (Oberheim et al. , 2009; Уоррен и др., 2009; Чжан и др., 2016). Также доступны более сложные модели BBB, такие как сфероидные или микрожидкостные модели, которые предлагают более близкое представление о среде in vivo .Однако эти установки сложны и дороги в сборке (Ruck et al., 2015). Следовательно, существует необходимость в разработке многоклеточной трансвелловой модели, которая включает в себя несколько типов клеток NVU для изучения их взаимодействий, особенно роли нейронов и их влияния на прочность барьера как при физиологических, так и при болезненных состояниях. Системы Transwell по-прежнему имеют явное преимущество в том, что они относительно просты в настройке и управлении, а также предлагают ряд конечных точек для изучения. Измерение TEER в этих типах моделей является обычным явлением, поскольку оно обеспечивает надежную, неинвазивную количественную оценку целостности барьера, позволяя проводить повторные измерения в течение желаемого периода времени с минимальным повреждением клеток (Srinivasan et al. , 2015). В дополнение к этому модели трансвелла обеспечивают доступ как к апикальному, так и к базолатеральному (базальному) отсеку для применения лекарств и отбора проб среды, а также позволяют визуализировать клетки в ходе эксперимента.

Поэтому нашей целью было создание новой четырехклеточной модели ГЭБ человека для изучения изменений проницаемости после кислородно-глюкозной депривации (OGD) и для использования в фармакологии in vitro . Первоначально мы сосредоточились на разработке модели, уточняя протокол, впервые описанный Hind (2014), путем оптимизации самих вставок, покрытия вставок, плотности посева клеток и сроков культивирования клеток.Наконец, мы внедрили метод посева нейронов на пластиковые покровные стекла, которые помещали на дно 12-луночных планшетов для культивирования клеток. Таким образом, наша модель сохраняет простоту установки трансвелла, но использует четыре первичные клетки человека, что делает ее более близким представлением среды человека in vivo .

Материалы и методы

Первичные клетки (астроциты, перициты, HBMEC и нейроны) и специализированная среда для культивирования клеток (среда для астроцитов, среда для перицитов, среда для эндотелиальных клеток и среда для нейронов) были получены от ScienCell, США, поставляемой Caltag Medsystems, Соединенное Королевство.Поли-L-лизин и свиной фибронектин также были получены от ScienCell, США, поставляемые Caltag Medsystems, Соединенное Королевство. Вставки с коллагеновым покрытием, 3,0 мкм, 12 мм, были получены от Corning, Соединенное Королевство. Пластиковые покровные стекла (Thermanox ^® диаметром 13 мм), реагент для диссоциации Accutase и среда RPMI без глюкозы были получены от Thermo Fisher Scientific, Соединенное Королевство.

Клетки содержали во влажном инкубаторе (37°C, 5% CO ₂ ).Астроциты и перициты культивировали и использовали между пассажами 4 и 6. Эндотелиальные клетки микрососудов головного мозга человека (HBMEC) использовали между пассажами 3 и 5, а нейроны использовали в пассаже 1. Во время пересева колбы, содержащие HBMEC, покрывали 2 мкг⋅см ² фибронектина перед оживлением или делением клеток в соответствии с рекомендациями производителей. Клетки пассировали при 80-90% слиянии. Вставки содержали 1,2 мл среды в базолатеральном отсеке и 800 мкл в апикальном отсеке.

зонда STX-3 и омметр были получены от World Precision Instruments, Великобритания. Дексаметазон был получен от Sigma, Соединенное Королевство, и растворен в ДМСО при исходной концентрации 10 мМ, а затем разбавлен в среде для культивирования клеток. Анаэробные контейнерные системы GasPak ^TM EZ были получены от BD, Соединенное Королевство.

Проверка модели

Наша модель была основана на первоначальной совместной культуре, созданной Hind (2014) и предыдущих моделях Allen and Bayraktutan (2009).Наша модель была модифицирована и разработана в ходе ряда предварительных экспериментов, включая сравнение размеров пор вставки, покрытия вставки, организации клеток и добавления нескольких типов клеток.

Размер пор, размер вставки и покрытие

Первоначально сравнивались размеры пор вставок Corning, Соединенное Королевство (0,4 мкм против 3,0 мкм), а также планшетов для клеточных культур (12 лунок против 24 лунок). Это должно было определить наилучшую начальную настройку, обеспечивающую самое высокое и наиболее стабильное барьерное сопротивление, а также обеспечивающее наилучший контакт с ячейкой.Во время разработки протокола мы обнаружили, что добавление перицитов в меньшие 24-луночные планшеты дало плохие результаты и недостаточную TEER, что свидетельствует о неадекватном формировании барьера. Возможно, в результате неадекватного клеточного роста на такой небольшой площади поверхности и в такой среде. Поэтому 24-луночные планшеты были заменены обратно на 12-луночные, что привело к значительно более высоким показателям TEER. После работы, проведенной Niego и Medcalf (2013), мы также обнаружили, что вставки с размером пор 3,0 мкм имеют более высокие значения TEER, чем 0. Вставки размером 4 мкм, что свидетельствует о том, что усиленный контакт между клетками на апикальной и базолатеральной сторонах вставки приводит к большей прочности барьера, см. Рисунок 2А.

Рис. 2. Разработка протокола модели (A) измеряла трансэпителиальную резистентность (TEER) как маркер герметичности барьера, сравнивая 12-луночный планшет с транслункцией и 24-луночный планшет с транслункцией и вставкой с размером пор 3,0 мкм и 0,4 мкм. HBMEC высевают на апикальной стороне вставки, астроциты под ней и перициты на дне планшета. (B) Организация клеток была оптимизирована путем сравнения TEER, генерируемого смешанной культурой астроцитов и перицитов, перицитов или только астроцитов на нижней стороне трансвелловых вставок и астроцитов или перицитов на дне планшета для культивирования клеток. HBMEC высевали на апикальной стороне вставки. Данные представлены как среднее ± SEM, n = 4–6 из двух экспериментальных повторов. Статистический анализ, проведенный с использованием двухфакторного ANOVA с тестом множественных сравнений Турции, ^∗∗ P < 0. 01 и ^∗∗∗ P < 0,001 смешанная культура астроцитов и перицитов по сравнению с перицитами под вставкой и астроцитами на дне планшета. ^# P < 0,05 смешанная культура астроцитов и перицитов по сравнению с астроцитами под вставкой и перицитами на дне планшета.

Добавление нескольких типов ячеек и позиционирование ячеек

Несмотря на эти улучшения в модели совместного культивирования, потребность в дополнительных типах клеток была критической для создания более близкого представления in vivo BBB.Мы установили три различных установки, как показано на рисунке 1. В одном астроциты были высеяны на базолатеральной стороне вставок, а перициты на дне чашки для культивирования (рис. 1B), в другом перициты были высеяны на базолатеральной стороне вставок. в то время как астроциты были высеяны на дно чашки для культивирования (рис. 1C), и, наконец, последняя установка включала смешанную культуру астроцитов и перицитов, высеянную на базолатеральной стороне вставки (рис. 1D). Во всех протестированных моделях HBMEC были засеяны на апикальной стороне трансвелловой вставки.

Окончательная установка предлагала более близкое воспроизведение организации, проведенной на in vivo BBB, поскольку клетки будут находиться в прямом контакте, что позволит им обмениваться жизненно важными факторами роста, необходимыми для клеточного роста и развития. Мы обнаружили, что смешанная культура перицитов и астроцитов демонстрирует значительно более высокие значения TEER по сравнению с установкой с перицитами, посеянными на дне чашки, и астроцитами под вставкой или астроцитами на дне чашки и перицитами под вставкой на 3 и 4 дни. P < 0.05 и P <0,01 соответственно (рис. 2В). Кроме того, эта установка также считалась наиболее стабильной, как показали более стабильные показания TEER, и в целом была более физиологической. Таким образом, эта установка была использована в последующей разработке протокола для четырех ячеек.

Чтобы проверить жизнеспособность добавления нейронов в модель, мы первоначально посеяли нейроны на дно 12-луночного планшета, в котором были подвешены вставки. Однако это было невозможно, так как датчики TEER касались дна планшета, вызывая нежелательное повреждение клеток.Поэтому мы решили использовать покровные стекла, которые можно было бы расположить на дне планшета, но не занимать всю лунку, позволяя зонду находиться там, где клеток не было. После тестирования стеклянных и пластиковых покровных стекол, покрытых поли-L-лизином, мы обнаружили, что покровные стекла с пластиковым покрытием были наиболее эффективными в адгезии нейронов, и этот метод был использован в окончательной модели.

Обзор метода четырех ячеек

После оптимизации наша модель BBB с четырьмя ячейками состояла из четырех основных типов ячеек NVU, расположенных в схеме трансвелловой проницаемости (см. Рисунок 1E).Сборка этого включает посев различных типов клеток в разное время на апикальной и базолатеральной сторонах трансвелловой вставки. В течение этого времени нейроны высевают на пластиковые покровные стекла, помещенные на дно отдельного 12-луночного планшета, для развития нейритов перед соединением обеих частей модели в последний день создания модели. Среду для культивирования клеток в обоих отсеках заменяли через день, а окончательную установку оставляли для уравновешивания на 2 дня перед началом экспериментов.Более 85% вставок пригодны для использования в экспериментах, а модель остается жизнеспособной до 5 дней.

Покрытие вставки и посев астроцитов

В первый день базолатеральную сторону вставок трансвелл покрывали поли-L-лизином, а астроциты высевали на базолатеральную сторону вставок, см. рис. 3. Вкратце, 3,0 мкм, 12 мм вставки, покрытые коллагеном (Corning, Соединенное Королевство ) осторожно вынимали из упаковки и помещали в 12-луночные планшеты для культивирования клеток с помощью стерильных щипцов.Раствор поли-L-лизина (2 мкг/см ² ) готовили в стерильной воде, гомогенно перемешивали и осторожно пипетировали с помощью пипетки Пастера, чтобы только покрыть базолатеральную часть вставки, см. рис. 4A,i. Затем планшеты со вставками возвращали в инкубатор при 37°C, 5% CO ₂ на 1 ч в соответствии с рекомендациями поставщика. Через 1 ч планшеты вынимали из инкубатора и дважды промывали стерильной водой для удаления остатков поли-L-лизина. Всю оставшуюся жидкость удаляли осторожной аспирацией.Затем вставки Transwell перевернули внутрь планшета и сняли крышку (рис. 4B). На вставки с новым покрытием 100 мкл суспензии клеток астроцитов в среде астроцитов (3,13 × 10 ⁵ клеток) быстро пипетировали на базолатеральную сторону трансвелла и осторожно закрывали крышку (см. рис. 4C, ii). Планшеты возвращали в инкубатор для клеточных культур на 2-3 часа для прилипания клеток. По прошествии этого времени вставки Transwell переворачивали и избыток среды удаляли аспирацией.Среду добавляли в апикальное и базолатеральное отделения, см. рис. 4iii. Планшеты снова возвращали в инкубатор.

Рис. 3. Временная шкала, показывающая этапы создания модели. На 1-й день вставки покрывали и высевали астроциты на базолатеральной стороне вставок трансвелл, а на 3-й день перициты высевали на базолатеральной стороне вставок с образованием смешанной культуры. На 6-й день HBMEC высевали на апикальную сторону вставок, а нейроны высевали на покровные стекла с покрытием в отдельный 12-луночный планшет.На 10/11 день вставки осторожно вынимают из их текущего планшета и помещают во второй 12-луночный планшет, содержащий нейроны, высеянные на покровные стекла. Через 2 дня проводят измерения TEER, чтобы убедиться в адекватном формировании барьера. ^∗ В нашей лаборатории эксперименты OGD были начаты в этот момент и были жизнеспособны в течение 4–5 дней.

Рисунок 4. Настройка модели (A–D) и (i–v) . (A/i) Вставки помещают в 12-луночный планшет, покрывают поли-L-лизином и промывают, гарантируя удаление всей жидкости. (B/ii) Вставки осторожно переворачивают внутрь пластины и пластину удаляют. 100 мкл соответствующей клеточной суспензии осторожно помещают на нижнюю часть вставки. (C/ii) Дно планшета для клеточных культур действует как «крышка» и заменяется как можно быстрее, после чего планшеты возвращаются в инкубатор для прилипания клеток на 3–4 часа. (iv) В отдельном 12-луночном планшете покровные стекла помещают на дно чашки для культивирования, покрывают поли-L-лизином и засевают суспензией нейрональных клеток. (v) После того, как все клетки были посеяны в трансвеллах, вставки осторожно переносят в планшеты, содержащие нейроны на покровных стеклах.

Посев перицитов

На 2-й день планшеты вынимали из инкубатора и осторожно удаляли среду для астроцитов, чтобы не повредить слой клеток на базолатеральной стороне вставки. Затем вставки снова переворачивали и добавляли 100 мкл 6,25 × 10 ⁴ клеточной суспензии перицитов к клеточному слою астроцитов на базолатеральной стороне трансвелловых вставок, получая примерное соотношение астроцитов к перицитам 5:1 (Pardridge, 1999). .Крышки планшетов быстро заменяли и возвращали в инкубатор на 2–3 часа. По прошествии этого времени трансвелловые вставки переворачивали, любой избыток среды удаляли аспирацией и добавляли смесь среды для астроцитов и перицитов (1:1) в апикальный и базолатеральный компартменты.

HBMEC Засев

Как только астроциты и перициты достигли 90% слияния (приблизительно на 4-й день от начала моделирования, см. рисунок 3), среду астроциты:перициты (1:1) из апикального компартмента удаляли и добавляли 100 мкл клеточной суспензии HBMEC (7.5 × 10 ⁴ ) в среде HBMEC добавляли в апикальное отделение вставок Transwell и клетки оставляли для прилипания минимум на 5 часов, затем среду доводили до 700 мкл средой для эндотелиальных клеток и планшеты возвращали в инкубатор. .

Посев нейронов

В тот же день, что и посев HBMEC, пластиковые покровные стекла (диаметром 13 мм) покрывали поли-L-лизином и помещали в инкубатор для клеточных культур не менее чем на 1 час в соответствии с рекомендациями поставщика. Планшеты с покровными стеклами осторожно вынимали из инкубатора, покровные стекла дважды промывали стерильной водой и оставляли сушиться на воздухе в вытяжном шкафу для культивирования клеток.После этого криоконсервированные нейроны оживляли в 3 мл среды для нейронов (чтобы получить общий объем клеточной суспензии 4 мл) и добавляли по 100 мкл клеточной суспензии к каждому покровному стеклу (таким образом засевали с плотностью примерно 2,5 × 10 ⁴ клеток). на см ² в пределах оптимального диапазона согласно рекомендациям производителя) (рис. 4D,iv). Среду доливают через 2 ч и каждые 2–3 дня заменяют половину среды. После наблюдения под световым микроскопом нейроны начали демонстрировать обширный рост нейритов примерно на 5-й день.К этому моменту HBMEC почти сформируют сплошной монослой над астроцитами и перицитами. Затем трансвеллы осторожно вынимали из их текущего 12-луночного планшета с помощью стерильных щипцов и помещали в 12-луночный планшет, содержащий покровные стекла нейронов. Свежую среду HBMEC наносили на апикальное отделение, а смесь среды для перицитов, астроцитов и нейронов (1:1:2 соответственно) добавляли в базолатеральное отделение. Это было необходимо для поддержания низкой концентрации фетальной бычьей сыворотки, оптимальной для поддержания нейронов, а также для сохранения роста астроцитов и перицитов.Поскольку все клетки были конфлюэнтными и барьер был адекватно сформирован, условия можно было поддерживать в различных компартментах.

Протокол кислородно-глюкозной депривации (OGD)

Для повышения проницаемости барьера использовался протокол кислородно-глюкозной депривации (OGD), моделирующий последствия ишемического инсульта in vitro (Hind et al., 2015, 2016). Нормальную среду для культивирования клеток удаляли из вкладышей Transwell и заменяли средой RPMI, не содержащей глюкозы (Thermo Fisher Scientific, Великобритания), и помещали в среду с 0% O ₂ (анаэробный пакет GasPak ^TM Beckton Dickinson, Оксфорд, Великобритания). в течение 20 мин для обеспечения анаэробных условий еще на 4 ч.Начального периода предварительной подготовки не было. Реперфузию инициировали удалением планшетов из анаэробного кармана и возвращением клеток в их нормальную среду (среда HBMEC в апикальном отделе и в базолатеральном отделе смесь перицитов, астроцитов и нейронов, 1:1:2 соответственно). TEER измеряли исходно (0 часов), сразу после OGD (4 часа), через 24, 48 и 72 часа.

Оценка целостности барьера

Трансэпителиальная резистентность (TEER) была измерена до начала экспериментов OGD для обеспечения целостности модельного барьера; вставки должны иметь значение TEER ≥45 Ом/см ² (рис. 4v).Также проводилось наблюдение с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться в слиянии клеток и успешном образовании нейритов. Для обеспечения согласованности измерения TEER всегда следует считывать не менее чем через 24 часа после смены среды. Вкратце, электроды STX3 стерилизовали, помещая кончики зонда в 70% этанол, а затем уравновешивали в течение 15 минут в культуральной среде эндотелиальных клеток при комнатной температуре. Затем зонд STX был подключен к измерителю EVOM ² (Both World Precision Instruments, Соединенное Королевство) и вставлен во вставку Transwell.Электрод состоит из двух частей, которые имеют разную длину: более длинная часть электрода была помещена так, чтобы слегка касаться дна планшета для культивирования клеток, в то время как более короткий электрод располагался немного выше вставной чашки, не полностью контактируя со слоем клеток HBMEC. . Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить нейроны в нижней части клеточной пластины, см. технические комментарии и ограничения. Поскольку значения TEER очень чувствительны к изменениям, важно держать электрод в вертикальном положении и избегать наклона, так как это может вызвать колебания значений TEER.Было получено фоновое значение для вкладыша только со средой для культивирования клеток, которое вычиталось из каждого показания (показания повторялись дважды для обеспечения воспроизводимости), а затем умножались на 1,12 для определения площади вкладыша для клеточной культуры (см ² ) (Hind, 2014).

Дексаметазоновый протокол

Дексаметазон представляет собой синтетический глюкокортикоид, и несколько групп показали, что он способен искусственно повышать прочность барьера (Shi and Zheng, 2005; Pyrgos et al., 2010; Hind, 2014).Поэтому мы использовали дексаметазон в качестве положительного контроля для исследования любой потенциальной разницы в ответе трех- и четырехклеточной модели на применение лекарственного средства. Записывали исходные показания TEER и заменяли среду, затем в апикальное отделение трансвелловой вставки добавляли дексаметазон, получая конечную концентрацию 1 мкМ. TEER измеряли через 2, 4 и 24 часа.

Анализ данных

Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad prism (La Jolla, CA, США).Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и проанализированы с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Сидака или Турции. ^∗ P < 0,05 считалось значимым.

Технические комментарии и ограничения

Важным шагом для создания четырехклеточной модели является определение времени, а также возрождение и посев человеческих нейронов. Добавление ячеек в неправильное время приведет к тому, что модель будет работать не так эффективно, а значения TEER будут ниже ожидаемых.Поэтому мы наметили временную шкалу для настройки модели (рис. 2), шаги 4 и 5 могут варьироваться в зависимости от времени, необходимого для образования барьера и образования нейритов нейронами. Неправильная техника посева нейронов на покровные приведет к неравномерности и неадекватному образованию нейритов. Убедитесь, что покровные стекла достаточно высушены на воздухе, а суспензия нейронов тщательно, но адекватно перемешана в процессе возрождения и посева. Избегайте удаления нейронов из инкубатора в течение длительного времени.

При измерении значений TEER убедитесь, что большая часть зонда STX не касается нейронов, культивируемых на покровном стекле. Это особенно важно, если выполняется несколько измерений (рекомендуется). Также возможно использование нейронов после завершения первичных экспериментов. Окрашивание покровных стекол можно проводить с использованием различных методов, включая окрашивание йодидом пропидия (PI) и DAPI, можно лизировать нейроны и проводить внутриклеточные анализы.

Результаты

Разработка протокола

При разработке модели BBB сравнивались различные настройки, в том числе; введите размер пор, размер пластины и организацию клеток.На рис. 2 показаны этапы разработки протокола и соответствующие им значения TEER до добавления нейронов в модель. На рисунке 2А показано, что поры большего размера (3,0 мкм) демонстрируют большую барьерную целостность (о чем свидетельствуют более высокие показания TEER), чем поры меньшего размера (0,4 мкм). Кроме того, 12-луночные вставки показали значительно более высокие значения TEER, чем 24-луночные вставки. Продолжая разработку модели с использованием 12 вставок размером 3,0 мкм, на рисунке 2B сравниваются три различных набора клеточных культур через несколько дней после создания модели.На третий и четвертый дни вставки, содержащие смешанную культуру астроцитов и перицитов, демонстрировали значительно более высокие показания TEER, чем установки, содержащие астроциты или перициты, посеянные на нижней стороне вставок или на дне планшета для культивирования клеток, P < 0,05 и P <0,01 соответственно.

Моделирование модели OGD

Чтобы оценить влияние присутствия разных клеток, изменения TEER в моделях D и E, показанных на рис. 1, сравнивали в соответствии с протоколом OGD. На рисунке 5A показаны различные ответы трехклеточной и четырехклеточной модели в ответ на 4-часовой протокол OGD с последующим периодом реперфузии. Трехклеточный режим показал примерно 30-процентное снижение TEER по сравнению с исходным уровнем через 4 часа OGD. Это контрастирует с моделью с четырьмя ячейками, которая показала 50% снижение TEER после OGD и значительно отличалась от модели с тремя ячейками P <0,05. После OGD, когда была начата реперфузия, TEER смогла вернуться к исходному уровню в трехклеточной модели, однако проницаемость ГЭБ восстановилась лишь незначительно на 20% в четырехклеточной модели.Это значительно отличалось через 24 часа ( P <0,01), но не через 48 или 72 часа. Изображения 5B и C показывают световой микроскоп изображения нейронов в четырехклеточной модели до и сразу после протокола OGD, соответственно. На рисунке 5C отчетливо видны скопления нейронов вместе с очевидной фрагментацией нейритов по сравнению с рисунком 5B, показывающим здоровые нейроны до OGD.

Рисунок 5. (A) Влияние протокола 4-часовой кислородно-глюкозной депривации (OGD) на трансэпителиальную резистентность (TEER) как маркер герметичности барьера в трехклеточной модели (HBMEC, астроциты и перициты) и четырехклеточная модель (HBMEC, астроциты, перициты и нейроны).Нейронные изображения, полученные из четырехклеточной модели (B) до OGD 40× и (C) изображений нейронов сразу после OGD 40×. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n = 3–6 из двух экспериментальных повторов, рассчитанное как процентное изменение от исходных показаний TEER. Статистический анализ был проведен с использованием двухстороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Сидака, ^∗ P <0,05 и ^∗∗ P <0,01 считались значимыми.

Применение дексаметазона

Дексаметазон повышал плотность барьера во всех трех моделях, о чем свидетельствует увеличение TEER и общая значимость в результате взаимодействия лекарственных средств в трехклеточной и четырехклеточной модели, P < 0. 05. Модель с двумя ячейками была самой нестабильной из трех моделей, о чем свидетельствуют большие колебания и изменчивость измерений TEER (рис. 6А). Трехклеточная модель была значительно более стабильной, но различия в TEER между обработанными дексаметазоном и контролем наблюдались только через 2 часа (рис. 6B). Четырехклеточная модель показала самое быстрое увеличение плотности барьера (т. е. увеличение TEER) в результате применения дексаметазона (рис. 6C), и это достигло значимости по сравнению с контрольным носителем через 2 и 24 ч ( P < 0.05).

Рисунок 6. Влияние дексаметазона на трансэпителиальную резистентность (TEER) как меру плотности барьера в (A) двухклеточном (астроциты и HBMECs), (B) трехклеточном (астроциты, HBMECs и перициты) и (C) четырехклеточная модель (астроциты, HBMEC, перициты и нейроны). Дексаметазон (1 мкМ) добавляли к люминальной стороне и использовали в качестве положительного контроля, который, как известно, снижает проницаемость и, таким образом, увеличивает TEER. Данные представлены как среднее ± SEM, n = 4 из двух экспериментальных повторов.Статистический анализ был проведен с использованием двухстороннего ANOVA с тестом множественных сравнений Сидака, ^∗ P <0,05 считалось значимым.

Обсуждение

ГЭБ может быть нарушен при различных состояниях, включая, помимо прочего, ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера, рак и рассеянный склероз (РС). Исследования этих расстройств, влияющих на ГЭБ, затруднены трансляционными трудностями, в результате чего многие потенциальные соединения и / или методы лечения не могут превзойти клинические испытания фазы I / II.Это, по крайней мере частично, связано с отсутствием подходящих моделей in vitro , которые могут предсказывать эффективность лекарств на доклинических этапах. Большинство, если не все, современные модели BBB имеют «подводные камни», будь то стоимость, время или ресурсы. Модели, которые предлагают наиболее близкое представление о ГЭБ, часто сложны и дороги в воспроизведении, что увеличивает стоимость процесса скрининга лекарств. Чтобы улучшить переводимость данных in vitro , мы разработали модель в стиле Transwell, которая включает четыре основных типа клеток человека, представляя NVU больше, чем другие доступные в настоящее время модели BBB.Мы обнаружили, что наша новая четырехклеточная модель лучше моделирует ишемический инсульт и применение лекарств in vitro по сравнению с трехклеточной и двухклеточной моделью, что показано изменениями TEER как меры целостности барьера и применением дексаметазона.

Последствия тестирования на наркотики

Эффект дексаметазона оценивали на трех трансвелл-моделях; модель с двумя, тремя и четырьмя ячейками. Большая нестабильность барьерной силы и более медленный ответ были обнаружены в двухклеточной модели после применения дексаметазона.Это также может свидетельствовать о том, что модели, содержащие только два типа клеток, в данном случае астроциты и HBMEC, также будут по-разному реагировать на применение других лекарств, и поэтому их недостаточно для реального моделирования взаимодействия лекарств на ГЭБ. В то время как модель с тремя клетками имела ту же тенденцию к увеличению прочности барьера, она демонстрировала более стабильные значения TEER по сравнению с моделью с двумя клетками, а лунки, обработанные дексаметазоном, в целом значительно отличались от контрольных лунок с носителем. Кроме того, введение перицитов (создание трехклеточной модели) привело к значительному увеличению базового уровня TEER с 30 до 40 Ом, что еще раз подчеркивает роль перицитов в укреплении стабильности сосудов при ГЭБ и необходимость их присутствия в моделях ГЭБ (Bergers и Song, 2005; Dohgu et al., 2005; Накагава и др., 2007 г.; Ferland-McCollough et al., 2017) Интересно, что модель с четырьмя клетками продемонстрировала значительное увеличение плотности барьера (о чем свидетельствует увеличение TEER) по сравнению с контрольным носителем всего через 2 часа после применения дексаметазона. Хотя нейроны в этой модели напрямую не взаимодействуют с ГЭБ, было показано, что нейроны секретируют ряд вазоактивных веществ, включая VEGF, которые влияют на свойства формирования барьера и ранний ангиогенез (Engelhardt, 2003; Eichmann and Thomas, 2013). Эти сравнительные данные подчеркивают различия в данных, полученных на моделях, содержащих разные типы клеток, и их влияние на скрининг наркотиков. Это подчеркивает важность наличия более репрезентативной модели BBB, содержащей дополнительные клетки, присутствующие в NVU.

Последствия для тестирования протокола

В настоящее время имеется широкий спектр доступных моделей in vitro ГЭБ, но, несмотря на многообещающие разработки в моделировании ГЭБ, в разработке моделей все еще существуют пробелы, в первую очередь невозможность включить все типы клеток, присутствующие в NVU.В то время как большинство трансвелловых систем включают астроциты и HBMEC, только в более поздних исследованиях в эти модели были введены перициты или нейроны. Чтобы лучше понять, как эти клетки способствуют разрушению ГЭБ в условиях ишемии, мы подвергли наши трехклеточные и четырехклеточные модели протоколу OGD и измерили TEER в течение долгого времени, чтобы оценить изменения в целостности барьера. Интересно, что мы обнаружили, что при наличии нейронов наша модель демонстрировала большее снижение TEER по сравнению с трехклеточной моделью, которая содержала только астроциты, перициты и HBMEC.Точно так же, в то время как модель с тремя клетками смогла восстановиться через 24 часа после OGD, модель с четырьмя клетками восстановилась лишь незначительно, примерно на 20%, что подчеркивает роль и чувствительность нейронов в уровне повреждения, вызванного протоколом OGD. В целом мы показали, что с добавлением нейронов наша модель стала более уязвимой к повреждениям; демонстрируя большую потерю прочности барьера, показанную снижением TEER, подтверждая предыдущую работу, которая показала, что ишемизированные нейроны разрушают эндотелиальный барьер за счет увеличения секреции VEGF (Li et al., 2014). Таким образом, исключение нейронов из моделирования инсульта ГЭБ привело бы к недооценке вызванного повреждения и вклада нейронов в разрушение ГЭБ после ишемии.

Ограничения и будущее развитие

Хотя наша модель теперь включает четыре клетки, присутствующие в NVU, наша модель не включает поток, который является важной особенностью для поддержания фенотипа BBB in vitro. Исследования показали, что чистый стресс имеет решающее значение для увеличения продолжительности жизни клеток и влияния на клеточный фенотип, регулирования транспорта ГЭБ, предотвращения дедифференцировки (Desai et al., 2002; Чиу и др., 2005; Партыка и др., 2017). Культивирование HBMECs при физиологическом сдвиговом напряжении особенно важно в условиях ишемического инсульта, поскольку происходит прерывание кровотока. Преимущество микрожидкостных систем, имитирующих физиологический поток, заключается в том, что они могут имитировать непрерывный поток, улучшая трансляцию в окружающую среду (Partyka et al., 2017; Wang et al., 2017).

Точно так же появляется все больше доказательств роли клеток микроглии в разрушении ГЭБ.Было показано, что эти резидентные иммунные клетки головного мозга высвобождают провоспалительные медиаторы, которые повышают проницаемость барьера и снижают уровень некоторых TJ, таким образом, играя ключевую роль в разрушении ГЭБ при патологических состояниях (da Fonseca et al. , 2014; Shigemoto-Mogami et al. ., 2018) Таким образом, будущая работа должна оценить, могут ли дополнительные ячейки и напряжение сдвига быть включены в модели типа Transwell.

Заключение

Общая функция NVU заключается в перфузии мозговой ткани для снабжения нейронов необходимыми питательными веществами и способности нейронов регулировать этот кровоток.Глия, а именно астроциты, выступают посредниками между сосудистым и нервным компартментами (Lo et al., 2015). Перициты обеспечивают дополнительный уровень связи между эндотелием и астроцитами, а также выполняют важную иммунную функцию (Darland et al., 2003; Armulik et al., 2011; Kovac et al., 2011). При церебральной ишемии эти сложные взаимодействия нарушаются, и гомеостаз утрачивается вследствие функциональных, морфологических и метаболических изменений внутри НВУ (Lo et al., 2015).Важно смоделировать, как эти клетки взаимодействуют как в нормоксических, так и в ишемических условиях, чтобы изучить патофизиологию ишемического инсульта. Наконец, системы Transwell предлагают заметные преимущества по сравнению с более сложными моделями, поскольку они поддерживают более простую настройку клеточной культуры и часто используют минимальные ресурсы. Мы считаем, что наша модель предлагает более точное представление о ГЭБ, сохраняя при этом простоту установки трансвелла.

Доступность данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Вклад авторов

NS выполнил исследование. TE и SO’S разработали исследование. NS и SO’S проанализировали данные. NS, TE и SO’S написали рукопись.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (грант № BB/M008770/1).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Ссылки

Abbott, N.J., Patabendige, A.A.K., Dolman, D.E.M., Yusof, S.R., and Begley, D.J. (2010). Структура и функция гематоэнцефалического барьера. Нейробиол. Дис. 37, 13–25. doi: 10.1016/j.nbd.2009.07.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аллен, К.Л., и Байрактутан, У. (2009). Антиоксиданты ослабляют опосредованную гипергликемией дисфункцию эндотелиальных клеток головного мозга и гиперпроницаемость гематоэнцефалического барьера. Диабет Ожирение. Метаб. 11, 480–490. doi: 10.1111/j.1463-1326.2008.00987.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Appelt-Menzel, A., Cubukova, A., Günther, K., Edenhofer, F., Piontek, J., Krause, G., et al. (2017). Создание модели совместной культуры гематоэнцефалического барьера человека, имитирующей нейроваскулярную единицу, с использованием индуцированных плюри- и мультипотентных стволовых клеток. Представитель стволовых клеток 8, 894–906. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.02.021

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Армулик А., Женове Г. и Бетшольц К. (2011). Перициты: развитие, физиологические и патологические перспективы, проблемы и перспективы. Дев. Ячейка 21, 193–215. doi: 10.1016/j.devcel.2011.07.001

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аттвелл, Д., Бьюкен, А.М., Чарпак, С., Лауритцен, М., МакВикар, Б.А., и Ньюман, Э.А. (2010). Глиальный и нейрональный контроль мозгового кровотока. Природа 468, 232–243. doi: 10.1038/nature09613

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Борхес, Н., Ши Ф., Азеведо И. и Аудус К.Л. (1994). Изменения проницаемости монослоя эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга под действием адренергических препаратов. евро. Дж. Фармакол. Мол. Фармакол. 269, 243–248. дои: 10.1016/0922-4106(94)-2

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Chiu, J. J., Chen, L.J., Chang, S.F., Lee, P.L., Lee, C.I., Tsai, M.C., et al. (2005). Напряжение сдвига ингибирует экспрессию генов воспаления, индуцированную клетками гладкой мускулатуры, в эндотелиальных клетках: роль NF-κB. Артериосклероз. тромб. Васк. биол. 25, 963–969. doi: 10.1161/01.ATV.0000159703.43374.19

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Cho, C.F., Wolfe, J.M., Fadzen, C.M., Calligaris, D., Hornburg, K., Chiocca, E.A., et al. (2017). Сфероиды гематоэнцефалического барьера как платформа для скрининга агентов, проникающих в мозг, in vitro. Нац. коммун. 8:15623. doi: 10.1038/ncomms15623

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

да Фонсека, А.C.C., Matias, D., Garcia, C., Amaral, R., Geraldo, L.H., Freitas, C., et al. (2014). Влияние активации микроглии на гематоэнцефалический барьер при заболеваниях головного мозга. Фронт. Клетка. Неврологи. 8:362. doi: 10.3389/fncel. 2014.00362

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Darland, D.C., Massingham, L.J., Smith, S.R., Piek, E., Saint-Geniez, M., и D’Amore, P.A. (2003). Продукция перицитами ассоциированного с клеткой VEGF зависит от дифференцировки и связана с выживаемостью эндотелия. Дев. биол. 264, 275–288. doi: 10.1016/j.ydbio.2003.08.015

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Desai, S.Y., Marroni, M., Cucullo, L., Krizanac-Bengez, L., Mayberg, M.R., Hossain, M.T., et al. (2002). Механизмы выживания эндотелия при сдвиговом напряжении. Эндотель. Дж. Эндотель. Сотовый рез. 9, 89–102. дои: 10.1080/10623320212004

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Дохгу С., Таката Ф., Ямаути А., Nakagawa, S., Egawa, T., Naito, M., et al. (2005). Перициты головного мозга способствуют индукции и усилению функций гематоэнцефалического барьера за счет продукции трансформирующего фактора роста-β. Мозг Res. 1038, 208–215. doi: 10.1016/j.brainres.2005.01.027

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дор-Даффи, П. (2008). Перициты: полипотентные клетки гематоэнцефалического барьера. Курс. фарм. Дес. 14, 1581–1593. дои: 10.2174/138161208784705469

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ферланд-МакКоллоу, Д., Слейтер С., Ричард Дж., Рени К. и Мангиаларди Г. (2017). Перициты, упускаемый из виду игрок в сосудистой патобиологии. Фармакол. тер. 171, 30–42. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.11.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Gaillard, P.J., Voorwinden, L.H., Nielsen, J.L., Ivanov, A., Atsumi, R., Engman, H., et al. (2000). Создание и функциональная характеристика модели гематоэнцефалического барьера in vitro, включающей совместную культуру эндотелиальных клеток капилляров головного мозга и астроцитов. евро. Дж. Фарм. науч. 12, 215–222. doi: 10.1016/S0928-0987(00)00123-8

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Харц, А.М.С., Миллер, Д.С., и Бауэр, Б. (2010). Восстановление гематоэнцефалического барьера Р-гликопротеин снижает содержание амилоида в мозге в мышиной модели болезни Альцгеймера. Мол. Фармакол. 77, 715–723. doi: 10.1124/моль.109.061754

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hind, WH (2014). Влияние каннабиноидов на проницаемость гематоэнцефалического барьера in vitro. к.т.н. диссертация, Ноттингемский университет, Ноттингем.

Академия Google

Hind, W.H., England, T.J., и O’Sullivan, S.E. (2016). Каннабидиол защищает модель гематоэнцефалического барьера in vitro от кислородно-глюкозного голодания через рецепторы PPARγ и 5-HT1A. Бр. Дж. Фармакол. 173, 815–825. doi: 10.1111/bph.13368

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хинд, В. Х., Туфарелли, К., Неофиту, М., Андерсон, С.И., Англия, Т.Дж., и О’Салливан, С.Е. (2015). Эндоканнабиноиды модулируют проницаемость гематоэнцефалического барьера человека in vitro. Бр. Дж. Фармакол. 172, 3015–3027. doi: 10.1111/bph.13106

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Касем К., Лакомб П., Сейлаз Дж. и Бонвенто Г. (1998). Структурная организация периваскулярных концов астроцитов и их взаимосвязь с эндотелиальным переносчиком глюкозы: исследование с помощью конфокальной микроскопии. Глия 23, 1–10.

Реферат PubMed | Академия Google

Ковач, А., Эриксон, М.А., Бэнкс, В.А., Нойвельт, Э., Эбботт, Н., Эбри, Л., и соавт. (2011). Перициты микрососудов головного мозга иммуноактивны в культуре: экспрессия цитокинов, хемокинов, оксида азота и LRP-1 в ответ на липополисахарид. J. Нейровоспаление. 8:139. дои: 10.1186/1742-2094-8-139

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Ю. Н., Пан, Р., Qin, X.J., Yang, W.L., Qi, Z., Liu, W., et al. (2014). Ишемизированные нейроны активируют астроциты, чтобы разрушить эндотелиальный барьер посредством увеличения экспрессии VEGF. Дж. Нейрохим. 129, 120–129. doi: 10.1111/jnc.12611

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Liebner, S., Corada, M., Bangsow, T., Babbage, J., Taddei, A., Czupalla, C.J., et al. (2008). Передача сигналов Wnt/β-catenin контролирует развитие гематоэнцефалического барьера. Дж. Сотовый. биол. 183, 409–417.doi: 10.1083/jcb.200806024

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ло Э., Менделоу А., Сакко Р. и Вонг Л. (2015). «7. Нервно-сосудистый блок и реакция на ишемию», в Stroke , eds J. Grotta, G. Albers, J. Broderickm, S. Kasner, E. Lo, R. Sacco, et al. (Амстердам: Эльзевир).

Академия Google

Мартини Ф. и Варфоломей Э. Ф. (2017). Основы анатомии и физиологии. Амстердам: Эльзевир.

Академия Google

Накагава, С., Дели, М.А., Кавагути, Х., Симизудани, Т., Шимоно, Т., Киттель, А, и др. (2009). Новая модель гематоэнцефалического барьера с использованием первичных эндотелиальных клеток головного мозга крысы, перицитов и астроцитов. Нейрохим. Междунар. 54, 253–263. doi: 10.1016/j.neuint.2008.12.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Накагава С., Дели М.А., Накао С., Хонда М., Хаяши К., Накаоке Р. и др. (2007). Перициты из микрососудов головного мозга усиливают целостность барьера в первичных культурах эндотелиальных клеток головного мозга крысы. Сотовый. Мол. Нейробиол. 27:687. doi: 10.1007/s10571-007-9195-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ниего, Б., и Медкалф, Р.Л. (2013). Усовершенствованный метод подготовки контактной модели гематоэнцефалического барьера на основе клеток человека ^∗ . Дж. Вис. Эксп. 81:e50934. дои: 10.3791/50934

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нзоу Г., Уикс Р. Т., Уикс Э. Э., Сил С.A., Sane, C.H., Chen, A., et al. (2018). Сфероид коры головного мозга человека с функциональным гематоэнцефалическим барьером для высокопроизводительного скрининга нейротоксичности и моделирования заболеваний. Науч. Респ. 8:7413. doi: 10.1038/s41598-018-25603-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Oberheim, N.A., Takano, T., Han, X., He, W., Lin, J.H.C., Wang, F., et al. (2009). Уникальные гоминидные черты астроцитов взрослого человека. J. Neurosci. 29, 3276–3287. дои: 10.1523/JNEUROSCI.4707-08.2009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Partyka, P.P., Godsey, G.A., Galie, J.R., Kosciuk, M.C., Acharya, N.K., Nagele, R.G., et al. (2017). Механический стресс регулирует транспорт в соответствующей 3D-модели гематоэнцефалического барьера. Биоматериалы 115, 30–39. doi: 10.1016/j.biomaterials.2016.11.012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пипер К., Пиелох П. и Галла Х.Дж. (2013). Перициты поддерживают трансмиграцию нейтрофилов через интерлейкин-8 через модель совместного культивирования свиней через гематоэнцефалический барьер. Мозг Res. 1524, 1–11. doi: 10.1016/j.brainres.2013.05.047

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пиргос, В., Миккиен, Д., Сейн, Т., Коттон, М., Франсескони, А., Мизрахи, И., и соавт. (2010). Влияние иммуномодулирующих и ассоциированных с организмом молекул на проницаемость модели гематоэнцефалического барьера in vitro для амфотерицина В и флуконазола. Антимикроб. Агенты Чемотер. 54, 1305–1310. doi: 10.1128/AAC.01263-09

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рисау, В., Холлманн, Р., и Альбрехт, У. (1986). Зависимая от дифференцировки экспрессия белков в эндотелии головного мозга при развитии гематоэнцефалического барьера. Дев. биол. 117, 537–545. дои: 10.1016/0012-1606(86)

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ши, Л.З. и Чжэн В. (2005). Создание эпителиальной транспортной системы барьера головного мозга in vitro для фармакологических и токсикологических исследований. Мозг Res. 1057, 37–48. doi: 10.1016/j.brainres.2005.07.046

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шигемото-Могами Ю., Хошикава К. и Сато К. (2018). Активированная микроглия разрушает гематоэнцефалический барьер и индуцирует хемокины и цитокины в модели крыс in vitro. Фронт. Клетка. Неврологи. 12:494. doi: 10.3389/fncel.2018.00494

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сринивасан, Б., Колли, А.Р., Эш, М.Б., Абачи, Х.Е., Шулер, М.Л., и Хикман, Дж.Дж. (2015). Методы измерения TEER для систем модели барьера in vitro. Дж. Лаб. автомат. 20, 107–126. дои: 10. 1177/2211068214561025

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Суини, доктор медицинских наук, Айядурай, С., и Злокович, Б.В. (2016).Перициты сосудисто-нервного блока: ключевые функции и сигнальные пути. Нац. Неврологи. 19, 771–783. doi: 10.1038/nn.4288

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Томсен, Л. Б., Беркхарт, А., и Моос, Т. (2015). Тройная культуральная модель гематоэнцефалического барьера с использованием эндотелиальных клеток головного мозга свиньи, астроцитов и перицитов. PLoS One 10:e0134765. doi: 10.1371/journal.pone.0134765

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван Ю., Ван, Н., Цай, Б., Ван, Г.Ю., Ли, Дж., и Пяо, X.X. (2015). In vitro модель гематоэнцефалического барьера, созданная совместным культивированием первичных церебральных микрососудистых эндотелиальных и астроцитарных клеток. Нейронная регенерация. Рез. 10, 2011–2017 гг. дои: 10.4103/1673-5374.172320

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, Ю. И., Абачи, Х. Э., и Шулер, М. Л. (2017). Модель микрожидкостного гематоэнцефалического барьера обеспечивает барьерные свойства in vivo для скрининга проницаемости лекарств. Биотехнология. биоинж. 114, 184–194. дои: 10.1002/бит.26045

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Уоррен М.С., Зеранге Н., Вудфорд К., Робертс Л.М., Тейт Э.Х., Фенг Б. и соавт. (2009). Сравнительные профили экспрессии генов транспортеров ABC в эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга и головном мозге у пяти видов, включая человека. Фармакол. Рез. 59, 404–413. doi: 10.1016/j.phrs.2009.02.007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вайденфеллер, К., Свендсен, К.Н., и Шуста, Е.В. (2007). Дифференцирующиеся эмбриональные нейральные клетки-предшественники индуцируют свойства гематоэнцефалического барьера. Дж. Нейрохим. 101, 555–565. doi: 10.1111/j.1471-4159.2006.04394.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Йон, Дж. Х., На, Д., Чой, К., Рю, С. В., Чой, К., и Пак, Дж. К. (2012). Надежная система анализа проницаемости в микрожидкостном устройстве, имитирующем сосуды головного мозга. Биомед. Микроустройства. 14, 1141–1148.doi: 10.1007/s10544-012-9680-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhang, Y., Sloan, S.A., Clarke, L.E., Caneda, C., Plaza, C.A., Blumenthal, P.D., et al. (2016). Очистка и характеристика астроцитов-предшественников и зрелых астроцитов человека выявила транскрипционные и функциональные различия с мышами. Нейрон 89, 37–53. doi: 10.1016/j.neuron.2015.11.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Зонта, М., Angulo, M.C., Gobbo, S., Rosengarten, B., Hossmann, K.A., Pozzan, T., et al. (2003). Передача сигналов между нейронами и астроцитами занимает центральное место в динамическом контроле микроциркуляции головного мозга.