Определение реакции стержней: Определить реакции стержней и , общий шарнир которых нагружен

Содержание

Определить реакции стержней и , общий шарнир которых нагружен

Задача №9.

Определить реакции стержней и , общий шарнир которых нагружен, как показано на рис. 1.25, а, силами

Решение:

Выделим точку, равновесие которой следует рассмотреть, чтобы определить неизвестные реакции стержней. Здесь такой точкой является шарнир . Изобразим его отдельно на рис. 1.25, б.
Изобразим действующие на точку активные силы (нагрузки) и , действующие па шарнир вдоль нитей, к которым прикреплен каждый из грузов.
Мысленно освободим шарнир от связей (стержней) и заменим действие связей их реакциями и , направленными вдоль стержней и соответственно. Не всегда заранее можно определить, какой из стержней растянут или сжат. Например, в данном случае груз сжимает стержень и растягивает стержень , а груз — наоборот: растягивает стержень и сжимает стержень . Поэтому существует общепринятое правило считать предположительно все стержни растянутыми. В соответствии с этим правилом реакции и стержней на рис. 1.25, б направлены от шарнира к связям.

Приняв точку за начало координат, выберем положение осей (ocь абсцисс) и (ось ординат) таким образом, чтобы по крайней мере одна из них совпала с линией действия неизвестной силы, т. е. совместив одну из осей координат с осью какого-либо стержня. В данном случае (рис. 1.25, б) ось совмещена с осью стержня (можно было бы ось совместить с осью стержня ).
Определив при помощи данных на рис. 1.25, а углы, образуемые силами с осями и , определим проекции всех сил на каждую из осей и составим из этих проекций уравнения равновесия для плоской системы сходящихся сил:

Решаем получившуюся систему уравнений. Благодаря тому, что ось совпадает с осью стержня , ось перпендикулярна к этому стержню. Проекция (реакция стержня ) на ось равняется нулю, и второе уравнение содержит только одно неизвестное.

Из уравнения (1.8) имеем

Знак «минус» перед численным значением показывает, что вектор (рис. 1.25, б) должен быть направлен в противоположную сторону, т. е. стержень не растянут, как предполагалось, а сжат силой 0,315 кН (315 Н).

Из уравнения (1.7) имеем

откуда = 0,6 кН.

Численное значение положительно, значит, предположительно выбранное направление вектора соответствует действительному и стержень растянут силой 0,6 кН (600 Н).

Решение задачи обязательно следует проверить. Лучшим способом проверки может быть либо решение с помощью иного выбора осей координат (решите эту задачу, совместив ось с осью стержня ), либо решение задачи иным методом, например, графически.

Графическое решение задачи (оно показано на рис. 1.25, в) очень просто выполнять с помощью линейки с миллиметровой шкалой и транспортира. Из произвольной точки откладываем вертикально вниз (так направлена сила ) вектор , который в некотором масштабе

изображает силу . Из точки параллельно действию силы на шарнир в том же масштабе откладываем вектор , изображающий силу

Затем из точек а и с проводим прямые, параллельные соответственно стержню и стержню . Эти прямые пересекаются в точке . Образовался замкнутый многоугольник , в котором сторона изображает реакцию стержня , а сторона — реакцию стержня ( ). Причем стрелки у этих сторон показывают, который из стержней сжат или растянут.

Ответ:

Эта задача с решением взята со страницы решения задач по предмету «прикладная механика»:

Решение задач по прикладной механике

Возможно эти страницы вам будут полезны:

Задача №7. Определить силу давления ступенчатой колонны (рис. 1.23, а) на горизонтальную опору и силы взаимодействия частей колонны по сечению . Сила тяжести (вес) верхней части колонны = 30 кН, нижней = 60 кН.

Задача №8. Определить опорные реакции, возникающие при действии па брус силы =50 кН (силой тяжести бруса можно пренебречь). Расстояние между опорами = 2 м. Сила приложена посредине между опорами под углом 45° к оси бруса в точке (рис. 1.24, а).

Задача №10 (рис. 1.26, а). Определить силу , при которой цилиндр весом 500 Н начнет вкатываться на наклонную плоскость, а также реакцию наклонной плоскости. Трением пренебречь. Указание: в момент начала вкатывания цилиндр отрывается от горизонтальной опорной плоскости.

Задача №11 (рис. 1.27, а). Кулачковый механизм состоит из кулачка треугольной формы, движущегося равномерно под действием силы = 80 Н и получающего вертикальное перемещение толкателя с роликом па конце. В данном положении механизма ролик касается гипотенузы в ее середине. Определить реакцию горизонтальной опорной поверхности и силу давления кулачка на ролик. Весом частей механизма, а также трением пренебречь.

Расчетно-графическая работа. Определение реакций связей. Аналитический способ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕАКЦИЙ СТЕРЖНЕЙ

(аналитический способ)

Последовательность решения задачи

1. Выбрать тело (точку), равновесие которого следует рассматривать.

2. Освободить тело (шарнир В) от связей и изобразить действующие на него силы и реакции отброшенных связей. Причем реакции стержней следует направить от шарнира В, так как принято предлагать, что стержни растянуты.

3. Выбрать оси координат и составить уравнения равновесия, используя условия равновесия системы сходящихся сил на плоскости.

å F_i_х= 0;

å F_i_у= 0

Выбирая оси координат, следует учитывать, что полученные уравнения будут решаться проще, если одну из осей направить перпендикулярно одной из неизвестных сил.

Определить реакции стержней из решения указанной системы уравнений.

5. Проверить правильность полученных результатов, решив уравнения равновесия относительно заново выбранных координат Х и У.

Пример. Определить реакции стержней, удерживающих грузы

F₁=70 кН и F₂=100 кН (рис. 1). Массой стержней пренебречь.

Рис. 1 — Схема задачи

Решение:

1. Рассматриваем равновесие шарнира В (рис. 1).

2. Освобождаем шарнир В от связей и изображаем действующие на него активные силы и реакции связей (рис. 2).

3. Выбираем систему координат, совместив ось У по направлению с реакцией R₂ (рис. 2) и составляем уравнения равновесия для системы сил, действующих на шарнир

В:

Рис. 2 — Выбор систем координат

å F_i_х= 0; — R₁ cos 45 + F₂ cos 30 = 0 (1)

å F_i_у= 0; R₁ cos 45 + R₂ + F₂ cos 60 — F₁ = 0 (2)

4. Определяем реакции стержней R₁ и R₂ решая уравнения.

Из уравнения ( 1 ) получаем

Подставляя найденное значение R₁ в уравнение ( 2 ), получаем

R₂= F₁— F₂ cos 60 — R₁ cos 45 = 70 — 100 0,5 — 122  0,707 = — 66,6 кН

Знак минус перед значением R₂ указывает на то, что первоначально выбранное направление реакции неверное — следует направить реакцию

R₂ в противоположную сторону, то есть к шарниру В (на рис. 3 истинное направление реакции R₂ показано штриховым вектором).

Рис. 3 — Истинное направление реакций

5. Проверяем правильность полученных результатов, выбрав новое расположение осей координат Х и У (рис. 4). Относительно этих осей составляем уравнения равновесия:

Рис. 4 — Выбор систем координат

å F_i_х= 0; — R₂ cos 45 + F₂ cos 15 — F₁ cos 45 = 0 (3)

å F_i_у= 0; R₁ — F₁ cos 45 — R₂ cos 45 — F₂ cos 75 = 0 (4)

Подставляем значения реакций R₁ и R₂, полученные при решении уравнений (1) и (2), в уравнения (3) и (4).

Условия равновесия å F_i_х= 0;å F_i_у= 0 выполняется следовательно, задача решена правильно.

Задача. Определить реакции стержней, удерживающих грузы F₁ и F₂. Массой стержней пренебречь. Схему своего варианта смотри на рисунке 5. Числовые данные своего варианта взять из таблицы 1.

Таблица 1 — Исходные данные

Номер схемы на рисунке 5

F₁

F₂

Варианты

кH

Рис. 5 — Схема задачи

Раздел I самостоятельные и контрольные работы

ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящий сборник задач составлен в соответствии с программой дисциплины «Техническая механика», утвержденной Управлением кадров и учебных заведений Госстроя Российской Федерации и предназначенной для реализации Государственных образовательных стандартов среднего профессионального образования по специальностям 2900 группы Классификатора специальностей «Строительство и архитектура».

Сборник содержит 22 индивидуальных задания для контрольных (аудиторных) и расчетно-графических (домашних) работ по тридцати темам теоретической механики, сопротивления материалов и статики сооружений. Объем и содержание расчетно-графических и контрольных (самостоятельных) работ разработаны в соответствии с рекомендуемым перечнем расчетно-графических работ и примерной тематикой контрольных работ, предусмотренных Программой. Каждое задание содержит 36 вариантов, что делает его исключительно индивидуальным и наглядным.

Содержание и построение сборника имеют свои особенности.

Во-первых, все задания и задачи максимально ориентированы на строительные специальности и прежде всего на изучение специальной дисциплины «Строительные конструкции».

Расчетные схемы балок, рам, ферм, арок и т.д., поперечные сечения их элементов, виды внешних нагрузок наиболее характерны для конструкций и сооружений, встречающихся в строительстве. В то же время, они вполне вписываются в рамки общепрофессиональной дисциплины «Техническая механика».

В сборнике сделана попытка подготовить студентов к выполнению расчетов с учетом Строительных норм и правил (СНиПов), что предусмотрено программой.

Во-вторых, по каждой теме задания составлены двухуровневой сложности: контрольные или самостоятельные — более простые, а расчетно-графические — более сложные. Поэтому к расчетно-графической работе рекомендуется приступать после выполнения самостоятель-

ной работы по той же теме. Каждому заданию предшествует описание порядка решения задач с краткими методическими указаниями. Сборник содержит 38 примеров решения задач, близких по содержанию к задачам расчетных и контрольных работ.

Самостоятельные работы предназначены не только для контроля, но и для обучения. Для этого, по усмотрению преподавателя, они могут быть перегруппированы или сокращены.

В приложениях приведен справочный материал, необходимый для решения задач.

Глава 1 теоретическая механика. Статика

1.1. Определение реакций идеальных связей аналитическим способом

1. Указывают точку, равновесие которой рассматривается. В задачах для самостоятельной работы такой точкой является центр тяжести тела или точка пересечения всех стержней и нитей.

2. Прикладывают к рассматриваемой точке активные силы. В задачах для самостоятельной работы активными силами являются собственный вес тела или вес груза, которые направлены вниз (правильнее — к центру тяжести земли). При наличии блока вес груза действует на рассматриваемую точку вдоль нити. Направление действия этой силы устанавливается из чертежа. Вес тела принято обозначать буквой G.

3. Мысленно отбрасывают связи, заменяя их действие реакциями связей. В предлагаемых задачах используются три вида связей — идеально гладкая плоскость, идеально жесткие прямолинейные стержни и идеально гибкие нити, — в дальнейшем именуемые соответственно плоскостью, стержнем и нитью.

При замене связей их реакциями следует помнить, что реакция плоскости направлена по нормали (перпендикуляру) к ней в точке контакта (соприкосновения), а реакции стержня и нити — по их осям. При этом реакция плоскости направлена от нее и проходит через центр тяжести тела, а реакция нити — от рассматриваемой точки или тела (нить всегда испытывает растяжение). Направление реакции стержня заранее неизвестно, поэтому оно может быть принято произвольно. Если направление реакции стержня трудно определить из схемы, то его принимают растянутым, и реакцию направляют от рассматриваемой точки. Истинное направление будет установлено после решения уравнений.

Реакции нити и стержня принято называть усилиями. Реакцию плоскости обозначают буквой R, а усилие в нити и стержне — S или N. В дальнейшем, если не указывается вид связи или говорится о разных связях, то будет применяться термин «реакция».

К рассматриваемой точке прикладывают реакции связей. Лучше сделать это на отдельном чертеже, выполненном схематически, придерживаясь масштаба при изображении углов. В результате получают систему трех сходящихся сил. Активная сила (груз или собственный вес тела) известна, а реакции связей (их две) неизвестны.

4. Выбирают положение прямоугольной системы координат, Начало координат совмещают с точкой, равновесие которой рассматривается. Положение осей может быть выбрано произвольно и на конечном результате при правильном решении это не отражается. Обычно используют один из двух приемов для выбора направления осей координат. Первый: одну из осей (любую) направляют так, чтобы она совпала с направлением одной из неизвестных реакций, а другая при этом составляла бы с первой угол 90°. Второй: ось у направляют вертикально, а ось х — горизонтально. В частном случае возможен еще один прием для расположения осей: если система сил имеет ось симметрии, то одну из координатных осей совмещают с ней.

Во всех случаях следует определить углы между реакциями и координатными осями и указать их на чертеже.

5. Составляют уравнения равновесия вида:

Напомним, что проекцией силы на ось является произведение модуля (величины) этой силы на косинус угла между направлениями действия силы и оси. Если угол между направлениями силы и оси острый, то перед величиной проекции ставится знак «плюс», т. е. сила и ось направлены в одну сторону, если они направлены в противоположные стороны, то ставиться знак «минус».

Решают систему двух уравнений с двумя неизвестными. При этом если одна из осей совпадает с неизвестной реакцией, то одно из двух уравнений содержит только одно неизвестное, что упрощает решение системы.

Если ответ получится со знаком «минус», то это означает, что направление реакции на чертеже было выбрано неверно, т.е. если до составления уравнений равновесия стержень предполагался растянутым, то в действительности он будет сжатым, и наоборот. Такой ответ не является ошибкой решения (если оно выполнено верно), так как чертеж и ответ вместе дают возможность указать истинное направление реакции.

6. Выполняют проверку решения. Обычно она делается графическим или другими способами, но может быть выполнена и аналитически. Для этого следует изменить положение осей координат и решить задачу в новой системе. Ответы должны быть одинаковыми.

Пример 1. Определить величину и направление реакций связей для схемы, приведенной на рис. 1, а под действием груза С = 30 кН. Проверить правильность определения реакций.

Решение. 1. В задаче рассматривается равновесие тела, опирающегося на плоскость и подвешенного на нити. Заменим тело точкой 0, совпадающей с центром тяжести.

2. Приложим к точке О активную силу, которой является собственный вес тела G. Направим ее вниз (рис. 1, б).

3. Мысленно отбросим связи — плоскость и нить. Заменим их действие на точку 0 реакциями связей. Реакция плоскости (обозначим ее R) проходит по нормали к плоскости в точке А, а реакция или усилие в нити (обозначим ее 5) — по нити от точки. Обе реакции и вес тела или линии их действия должны пересекаться в точке 0.

Изобразим действующие силы в виде системы трех сходящихся сил на отдельном чертеже (рис. 1, в).

4. Выберем положение системы координат. Начало координат совмещаем с точкой 0. Ось х совмещаем с направлением линии действия реакции R, а ось у направим перпендикулярно оси х (рис. 1, г). Определим утлы между осями координат и реакциями R и S. Обычно рис. 1, б и 1, в не выполняют отдельно, а сразу от рис. 1, а переходят к рис. 1, г. Можно было ось у совместить с усилием S, и ось х направить по углом 90°, тогда решение было бы другим.

5. Составим сумму проекций всех сил на оси координат:

1) £ X = R + S cos 60° — G cos 40° — 0;

2)]Ty = Scos30⁰-Gcos50⁰ = 0.

Решим систему уравнений. Из второго уравнения находим

Из первого уравнения находим

6. Проверим решение, для чего расположим оси координат, как показано на рис. 1, д. Составим уравнения равновесия для вновь принятых осей:

Решим систему уравнений способом подстановки. Из первого уравнения найдем R:

Подставим это выражение во второе уравнение:

откуда

Теперь найдем R:

Очевидно, что при расположении осей, как показано на рис. 1, д, вычисления оказались более сложными.

Ответ: R = 11,84 кН; S = 22,27 кН.

Пример 2. Определить усилия в нити и стержне кронштейна, показанного на рис. 2, а, если G= 20 кН.

Решение. 1. Рассмотрим равновесие точки А (или узла А), в которой сходятся все стержни и нити.

2. Активной силой является вес груза G, направленный вниз (рис. 2, б).

3. Отбросим связи: стержень и нить. Усилие в нити обозначим S\ и направим от точки А, так как нить может испытывать только растяжение. Усилие в стержне обозначим S₂ и тоже направим от точки А, предполагая что стержень АС растянут (рис. 2, б).

Выполним на отдельном чертеже схему действия сил в точке А (рис. 2, в).

4. Выберем положение системы координат. Начало координат совмещаем с точкой А (рис. 2, г). Ось х совмещаем с линией действия усилия S₁, а ось у располагаем перпендикулярно оси х. Укажем углы между осями координат и усилиями Si и S₂.

5. Составим уравнения равновесия:

Из второго уравнения находим

Из первого уравнения находим

Знак «минус» перед S₂ свидетельствует о том, что стержень АС не растянут, как предполагалось, а сжат.

6. Проверку решения предлагаем выполнить самостоятельно, расположив оси координат так, как показано на рис. 2, д.

Ответ: S_} = 15,56 кН, S₂ = -29,24 кН (при принятом на чертеже направлении усилий).

Величина усилий зависит от углов наклона стержня и нити. Например, если на рис. 2, а угол 70° заменить на 60°, сохранив угол 30^Р, то усилия будут равны: Si = 20 кН, S₂ = -34,64 кН. А при угле 50° S_{ = 29,26 кН, S₂ = -44,8 кН. Оба усилия растут и становятся больше веса груза.

Пример 3. Как изменятся усилия в стержне и нити, если груз будет перекинут через блок, как показано на рис. 3, а>.

Остальные данные — в примере 2.

Решение. 1. Рассматриваемой точкой остается точка А. 1. Активная сила (вес груза G) действует на точку горизонтально слева направо, так как груз перекинут через блок.

3. Усилия Si и S₂ прикладываем к точке А, как в примере 2.

4. Выбираем систему координат, как показано на рис. 3, б.

5. Составляем и решаем уравнения равновесия:

Из первого уравнения находим

Из второго уравнения находим

Ответ: Si = 26,94 кН; S₂ = -10,64 кН при принятом направлении усилий на чертеже. Усилие Si увеличилось, S₂ — уменьшилось, а знаки не изменились.

Задание для самостоятельной работы 1. Определить величину и направление реакций связей по данным одного из вариантов, показанных на рис. 4.

Решение задач определить 📝 реакции стержней удерживающих грузы f1 и f2 м

1. Сколько стоит помощь?

Цена, как известно, зависит от объёма, сложности и срочности. Особенностью «Всё сдал!» является то, что все заказчики работают со экспертами напрямую (без посредников). Поэтому цены в 2-3 раза ниже.

2. Каковы сроки?

Специалистам под силу выполнить как срочный заказ, так и сложный, требующий существенных временных затрат. Для каждой работы определяются оптимальные сроки. Например, помощь с курсовой работой – 5-7 дней. Сообщите нам ваши сроки, и мы выполним работу не позднее указанной даты. P.S.: наши эксперты всегда стараются выполнить работу раньше срока.

3. Выполняете ли вы срочные заказы?

Да, у нас большой опыт выполнения срочных заказов.

4. Если потребуется доработка или дополнительная консультация, это бесплатно?

Да, доработки и консультации в рамках заказа бесплатны, и выполняются в максимально короткие сроки.

5. Я разместил заказ. Могу ли я не платить, если меня не устроит стоимость?

Да, конечно — оценка стоимости бесплатна и ни к чему вас не обязывает.

6. Каким способом можно произвести оплату?

Работу можно оплатить множеством способом: картой Visa / MasterCard, с баланса мобильного, в терминале, в салонах Евросеть / Связной, через Сбербанк и т.д.

7. Предоставляете ли вы гарантии на услуги?

На все виды услуг мы даем гарантию. Если эксперт не справится — мы вернём 100% суммы.

8. Какой у вас режим работы?

Мы принимаем заявки 7 дней в неделю, 24 часа в сутки.

Вариант 1. Задание 1 Определить аналитически и графически реакции стержней, удерживающих грузы весом F 1 =4 кн, F 2 =6 кн. Массой стержней пренебречь.

1 Вариант 1 Определить аналитически и графически реакции стержней, удерживающих грузы весом F 1 =4 кн, F 2 =6 кн. Массой стержней пренебречь. Балка с шарнирными опорами нагружена парой сил с моментом M=10 кн м, сосредоточенными силами F 1 =5 кн, F 2 =10 кн и равномерно распределенной нагрузкой интенсивностью q=7 кн/м. Определить реакции опор, если a=1 м, угол ά=30. Маховик диаметром d=0,9 м вращается равноускоренно из состояния покоя. Через t 1 =5 c точки, лежащие на ободе обладают линейной скоростью v=20 м/с. Найти частоту вращения маховика, скорость, нормальное и касательное ускорение точек обода маховика для момента времени t 2 =15 с. По условию и результату решения третьей задачи построить эпюру крутящих моментов, эпюры изгибающих моментов в вертикальной и горизонтальной плоскостях. Определить из условия прочности требуемый диаметр вала. Расчет произвести по гипотезе наибольших касательных напряжений, приняв [σ]=70 МПа. На равномерно вращающийся вал жестко насажены цилиндрические зубчатые колеса, нагруженные, как показано на рисунке. Силы F 1 =2,5 кн, F r1 =0,4 F 1, F r2 =0,4 F 2. Определить силу F 2 и реакции опор. Собственным весом деталей пренебречь.

2 Вариант 1 Для данного ступенчатого бруса, нагруженного силами F 1 =30 кн, F 2 =50 кн, построить эпюры продольных сил и нормальных напряжений по длине бруса. Определить изменение длины бруса, приняв Е= МПа, площади поперечного сечения А 1 =3 см 2, А 2 =2,5 см 2, А 3 =4 см 2. Проверить прочность бруса при [σ р ]=[σ]=160 МПа. Р=10 квт, при частоте вращения n=50 об/мин. Для материала борштанги: [τ]=50 МПа, G= МПа, l=1500 мм. Для заданной стальной балки построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов, подобрать из условия прочности требуемый размер сечения двутавра, приняв [σ]=180 МПа, F=10 кн, М=8 кн м, q=8 кн/м. Ведущее колесо 1 лебедки соединено с барабаном 2 шестью болтами, установленными в отверстия без зазора. Определить величину наибольшего груза, который может быть поднят лебедкой при обеспечении прочности болтов на срез и смятие. Центры болтов расположены по окружности диаметра D=600 мм, диаметр барабана D б =400 мм, диаметр посадочного места болтов d=15 мм. Допускаемые напряжения: [τ ср ]=50 МПа, [σ см ]=160 МПа. Для заданной двухопорной балки определить реакции опор, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов, определить из условия прочности требуемые размеры поперечного сечения прямоугольника и двутавра. Сравнить площади поперечных сечений и сделать вывод о целесообразности применения сечения. Соотношение сторон прямоугольника h=2b. F 1 =9 кн, F 2 =12 кн, М=7 кн м, а=1,2 м, [σ]=180 МПа. Для расточки глубокого отверстия применяют борштангу. Определить диаметр борштанги из условия прочности на кручение и угол ее закручивания, если мощность, передаваемая борштанге

3 Вариант 2 Кронштейн ABCD изготовлен из четырех шарнирно соединенных между собой стержней. На опоре кронштейн закреплен также при помощи шарниров. К шарниру А прикреплен груз, масса которого известна. Определить усилия во всех четырех узлах. Балка с шарнирно закреплена в точке А и удерживается в горизонтальном положении стержнем ВС, нагружена сосредоточенной силой F=10 кн, равномерно распределенной нагрузкой интенсивностью q=5 кн/м, парой сил с моментом M=15 кн м. Определить реакции опоры балки и стержня ВС, если a=1,4 м, угол ά=35. Рукоять для вращения барабана имеет длину l=0,6 м, а диаметр барабана d=0,35 м. Барабан под действием груза начинает вращаться с постоянным угловым ускорением ε=10 рад/с и через время t=6 c приобретает частоту вращения n. Определить частоту вращения барабана и нормальное ускорение конца рукояти, а также путь, пройденный грузом за это время. На равномерно вращающийся вал жестко насажены цилиндрические зубчатые колеса, нагруженные, как показано на рисунке. Силы F 1 =2,5 кн, F r1 =0,4 F 1, F r2 =0,4 F 2. Определить силу F 2 и реакции опор. Собственным весом деталей пренебречь. По условию и результату решения третьей задачи построить эпюру крутящих моментов, эпюры изгибающих моментов в вертикальной и горизонтальной плоскостях. Определить из условия прочности требуемый диаметр вала. Расчет произвести по гипотезе наибольших касательных напряжений, приняв [σ]=70 МПа.

4 Вариант 2 Для данного ступенчатого бруса, нагруженного силами F 1 =10 кн, F 2 =30 кн, F 3 =25 кн построить эпюры продольных сил и нормальных напряжений по длине бруса. Определить изменение длины бруса, приняв Е= МПа, площади поперечного сечения А 1 =3 см 2, А 2 =2,5 см 2, А 3 =4 см 2. Проверить прочность бруса при [σ р ]=[σ]=160 МПа. угол ее закручивания, если мощность, передаваемая борштанге Р=30 квт, при частоте вращения n=40 об/мин. Для материала борштанги: [τ]=80 МПа, G= МПа, l=2000 мм. Для заданной стальной балки двутаврового сечения построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Проверить ее прочность приняв [σ]=180 МПа, F=13 кн, М=4 кн м, q=5 кн/м. Рычаг укреплен на валу с помощью призматической шпонки с плоскими торцами. Проверить прочность шпонки на срез, шпоночное соединение на смятие, если b=15 мм, h=10 мм, t=6,5 мм, а=170 мм, d=50 мм, l=45 мм, F=7 кн, [τ ср ]=70 МПа, [σ см ]=110 МПа. Для заданной стальной двухопорной балки определить реакции опор, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Определить из условия прочности требуемые размеры поперечного сечения прямоугольника и швеллера. Сравнить площади поперечных сечений и сделать вывод о целесообразности применения сечения. Соотношение сторон прямоугольника h=2b. F 1 =10 кн, F 2 =14,5 кн, М=15 кн м, а=1,5 м, [σ]=200 МПа. Для расточки глубокого отверстия применяют борштангу. Определить диаметр борштанги из условия прочности на кручение и

5 Вариант 3 Груз удерживается с помощью троса и двух стержней AB и BC. Определить реакции стержней. Двухопорная балка нагружена сосредоточенной силой F=15 кн, равномерно распределенной нагрузкой интенсивностью q=15 кн/м, парой сил с моментом M=10 кн м. Определить реакции опор балки, если a=0,4 м. После отключения двигателя автомобиль массой 5 т, движущийся со скоростью 90 км/ч, прошел путь 450 м и остановился. Определить мощность, развиваемую двигателем в момент его отключения, если КПД трансмиссии 86 %. Определить через сколько времени остановился автомобиль, если сопротивление движению остается неизменным и автомобиль движется по горизонтальной поверхности. Определить угловую скорость секундной, минутной и часовой стрелок. На равномерно вращающийся вал жестко насажены цилиндрические зубчатые колеса, нагруженные, как показано на рисунке. Силы F 1 =2,5 кн, F r1 =0,4 F 1, F r2 =0,4 F 2. Определить силу F 2 и реакции опор. Собственным весом деталей пренебречь.

6 Вариант 3 Для данного ступенчатого бруса, нагруженного силами F 1 =20 кн, F 2 =5 кн построить эпюры продольных сил и нормальных напряжений по длине бруса. Определить изменение длины бруса, приняв Е= МПа, площади поперечного сечения А 1 =6 см 2, А 2 =3 см 2, А 3 =4,5 см 2. Проверить прочность бруса при [σ р ]=[σ]=160 МПа. Для заданной стальной балки сечения швеллер 14 построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Проверить ее прочность приняв [σ]=200 МПа, F=15 кн, М=10 кн м, q=10 кн/м. Трубчатый палец 1 соединяет деталь 2, нагруженную силой F, с деталью 3. Определить из условия прочности пальца на срез допускаемое значение силы F. Для полученного значения силы определить требуемые размеры а и b из условия прочности при смятии, если: [τ ср ] 1 =70 МПа, [σ см ] 2 =170 МПа, [σ см ] 3 =190 МПа, d=45 мм, d 0 =35 мм. Для заданной стальной двухопорной балки определить реакции опор, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Определить из условия прочности требуемый размер квадратного сечения балки. F 1 =14 кн, F 2 =9 кн, М=7 кн м, а=1,2 м, [σ]=160 МПа. Определить диаметр стального вала кольцевого сечения (c=d/d=0,6), если [τ]=45 МПа, [φ 0 ]=0,02 рад/м. Вал передает мощность Р=100 квт, при частоте вращения n=420 об/мин.

7 Вариант 4 Стержни AB и BC нагружены силой приложенной в точке В. Определить реакции стержней. Двухопорная балка нагружена сосредоточенными силами F 1 =15 кн, F 2 =20 кн, парой сил с моментом M=7 кн м. Определить реакции опор балки, если a=0,5 м. Свободная материальная точка, масса которой 5 кг, движется согласно уравнению S=5t 2 +2t. Определить величину движущей силы. К двум материальным точкам массой m 1 =3 кг и m 2 =9 кг приложены одинаковые силы. Сравнить величины ускорений. Для стального вала круглого поперечного сечения определить значения внешних моментов, соответствующих передаваемым мощностям и уравновешенный момент. Построить эпюру крутящих моментов по длине вала. Определить диаметры вала по сечениям из расчетов на прочность и жесткость. Полученные результаты округлить в большую сторону до числа кратному 5. Вал вращается с угловой скоростью 30 рад/с, материал вала сталь, допускаемое напряжение кручения 30 МПа, модуль упругости при сдвиге МПа, допускаемый угол закручивания [φ 0 ]=0,02 рад/м. P 1 =2 квт, P 2 =2,5 квт, P 3 =3000 квт, c=d/d=0,9.

8 Вариант 4 Для данного ступенчатого бруса, нагруженного силами F 1 =20 кн, F 2 =5 кн, F 3 =12 кн построить эпюры продольных сил и нормальных напряжений по длине бруса. Определить изменение длины бруса, приняв Е= МПа, площади поперечного сечения А 1 =2,3 см 2, А 2 =3,3 см 2. Проверить прочность бруса при [σ р ]=[σ]=160 МПа, а=0,3 м. Для заданной стальной двухопорной балки сечения швеллер 20 определить реакции опор, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Проверить ее прочность приняв [σ]=200 МПа, F=15 кн, М=10 кн м, q=10 кн/м, а=1,1 м. Трубчатый палец 1 соединяет деталь 2, нагруженную силой F, с деталью 3. Определить из условия прочности пальца на срез допускаемое значение силы F. Для полученного значения силы определить требуемые размеры а и b из условия прочности при смятии, если: [τ ср ] 1 =65 МПа, [σ см ] 2 =180 МПа, [σ см ] 3 =200 МПа, d=65 мм, d 0 =55 мм. Для заданной стальной балки определить реакции опоры, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Определить из условия прочности требуемый размер квадратного сечения балки. F 1 =14 кн, F 2 =9 кн, М=7 кн м, а=1,8 м, [σ]=160 МПа. Из расчетов на прочность и жесткость определить потребный диаметр вала для передачи мощности Р=50 квт при скорости 35 рад/с. Материал вала сталь, допускаемое напряжение при кручении 30 МПа, допускаемый относительный угол закручивания [φ 0 ]=0,02 рад/м, модуль упругости при сдвиге G= МПа.

9 Вариант 5 Стержни AB и BC нагружены силой приложенной в точке В. Определить реакции стержней. Тело вращалось равноускоренно из состояния покоя и сделало 500 оборотов за 3 мин. Определить угловое ускорение. Одноопорная балка нагружена сосредоточенными силами F 1 =8 кн, F 2 =12 кн, парой сил с моментом M=9 кн м. Определить реакции опоры балки, если a=0,3 м. Маховое колесо вращается равномерно со скоростью 100 об/мин. Радиус колеса 0,5 м. определить скорость и полное ускорение точек на ободе колеса, а также скорость точки, находящейся на расстоянии 0,25 м от центра. Для стального вала круглого поперечного сечения определить значения внешних моментов, соответствующих передаваемым мощностям и уравновешенный момент. Построить эпюру крутящих моментов по длине вала. Определить диаметры вала по сечениям из расчетов на прочность и жесткость. Полученные результаты округлить в большую сторону до числа кратному 5. Вал вращается с угловой скоростью 20 рад/с, материал вала сталь, допускаемое напряжение кручения 35 МПа, модуль упругости при сдвиге МПа, допускаемый угол закручивания [φ 0 ]=0,02 рад/м. P 1 =2 квт, P 2 =2,5 квт, P 3 =3000 квт, c=d/d=0,9.

10 Вариант 5 Для данного ступенчатого бруса, нагруженного силами F 1 =60 кн, F 2 =39 кн, F 3 =19 кн построить эпюры продольных сил и нормальных напряжений по длине бруса. Определить изменение длины бруса, приняв Е= МПа, площади поперечного сечения А 1 =2 см 2, А 2 =3 см 2. Проверить прочность бруса при [σ р ]=[σ]=160 МПа, а=0,5 м. Для заданной стальной двухопорной балки сечения двутавр 22 определить реакции опор, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Проверить ее прочность приняв [σ]=180 МПа, F 1 =15 кн, F 2 =15 кн, М=12 кн м, а=1 м. Трубчатый палец 1 соединяет деталь 2, нагруженную силой F, с деталью 3. Определить из условия прочности пальца на срез допускаемое значение силы F. Для полученного значения силы определить требуемые размеры а и b из условия прочности при смятии, если: [τ ср ] 1 =70 МПа, [σ см ] 2 =160 МПа, [σ см ] 3 =190 МПа, d=50 мм, d 0 =40 мм. Для заданной стальной балки определить реакции опоры, построить эпюры поперечных сил и изгибающих моментов. Определить из условия прочности требуемый размер квадратного сечения балки. F 1 =10 кн, F 2 =5 кн, М=3 кн м, а=0,8 м, [σ]=180 МПа. Из расчетов на прочность и жесткость определить потребный диаметр вала для передачи мощности Р=80 квт при скорости 15 рад/с. Материал вала сталь, допускаемое напряжение при кручении 45 МПа, допускаемый относительный угол закручивания [φ 0 ]=0,02 рад/м, модуль упругости при сдвиге G= МПа.

Новосибирский государственный архитектурно-строительный университет — Сибстрин

Студенты НГАСУ (Сибстрин) поучаствовали в строительстве новой ледовой арены МЧМ – 2023 в Новосибирске

В 2023 году Новосибирск примет молодежный чемпионат мира по хоккею. Матчи будут проводиться на новой многофункциональной ледовой арене, которая сейчас строится вблизи улицы Немировича-Данченко, в 500 метрах от берега реки Обь. Ввести в эксплуатацию новый спортивный комплекс планируют уже летом 2022 года. Студенты Новосибирского государственного архитектурно-строительного университета (Сибстрин) поучаствовали в стройке главного объекта МЧМ – 2023 в рамках производственной практики этим летом. Инициатива привлечь к строительству знаковых объектов области – ЛДС и станции метро «Спортивная» – студентов профильных вузов и бойцов студотрядов принадлежит Губернатору Андрею Травникову. «Сегодняшние новосибирские студенты смогут…

Приглашаем на мероприятия для первокурсников «Время первых 2021»!

Дорогие первокурсники НГАСУ (Сибстрин)! ЦВВР приглашает к участию в традиционных мероприятиях для новобранцев университета «Время первых 2021». Для вас организованы конкурсы среди групп первого курса: Интеллектуальный турнир – 4-5 октября «Эмблема моей группы» – 6 октября Конкурс на самую творческую группу – 6 октября Спартакиада на «Приз первокурсника» – 28-30 сентября Заявки на участие в конкурсах принимаются в свободной форме в учебном корпусе №4, ком. 4203, 4211 или на электронную почту [email protected] Пришло время первых – прояви свои таланты! Подробности – в Положениях о конкурсах. Интеллектуальный турнир Положение Спартакиада 1 курс 2021 Самая творческая группа Эмблема моей группы

Консорциум строительной отрасли Новосибирской области определил основные научные направления

В рамках деятельности научно-образовательного консорциума строительной отрасли Новосибирской области состоялась конференция по отбору тем в план научно-исследовательских работ. Мероприятие прошло 22 сентября 2021 года на базе НГАСУ (Сибстрин) в смешанном формате. Напомним, что научно-образовательный консорциум строительной отрасли, объединивший 17 организаций, в том числе вузы, научно-исследовательские институты СО РАН и ведущие отраслевые объединения строителей, был создан в апреле этого года. Его цель – интеграция усилий и ресурсов для обеспечения лидирующих позиций стройиндустрии Новосибирской области. С приветственным словом к участникам конференции обратились вице-президент консорциума, ректор НГАСУ (Сибстрин) Юрий Сколубович …

Лучшее студенчество с Российскими студенческими отрядами

Что значит быть профессионалом? Десятки тысяч часов проб и ошибок, оттачивание мастерства, опыт, мотивация стать лучшим в своем деле. Но для начала нужно найти то самое дело, в котором захочется стать профессионалом. Найти что-то свое. Российские студенческие отряды – это молодежная организация, которая помогает тысячам студентов не только найти работу на лето, но и попробовать себя в новой профессии, увидеть другую сторону жизни и понять, что точно не подходит. А еще – это коллектив единомышленников, активный досуг и новые возможности для личностного роста. Работая в составе студенческого отряда, вы получаете официальное трудоустройство и «белую» зарплату. Существует система компенсаций затрат на проезд и проживание от работодателя, можно получить бесплатно дополнительную рабочую специальность, что повысит…

Плоская система произвольно расположенных сил

Механика Плоская система произвольно расположенных сил

просмотров — 2887

ЗАДАЧИ

Задачи 1—10. Определить реакции стержней, удерживающих грузы F₁ и F₂. Массой стержней пренебречь. Схему своего варианта см. на рис. 4. Числовые данные своего варианта взять из табл. 2.

Таблица
№ варианта	№ схемы к задаче	F₁ F2	F₂ F2
кН
				0.4	0.5
				0.3	0.8
				0.6	0.4
				0.2	0.5
				0.5	0.8
				0.8	0.4
				0.4	0.2
				1.2	0.8
				0.8	1.0
				0.9	0.6

Во всех задачах требуется определить реакции опор балок. Необходимо приобрести навыки определения реакций опор, так как с этого начинается решение многих задач по сопротивлению материалов и деталям машин.

Последовательность решения задачи:

1. изобразить балку вместе с нагрузками;

2. выбрать расположение координатных осей, совместив ось х с балкой, а ось у направив перпендикулярно оси х;

3. произвести необходимые преобразования заданных активных сил: силу, наклоненную к оси балки под углом α, заменить двумя взаимно перпендикулярными составляющими, а равномерно распределенную по

закону прямоугольника нагрузку — ее равнодействующей, приложенной в середине участка распределения нагрузки;

4. освободить балку от опор, заменив их действие реакциями опор, направленными вдоль выбранных осей координат;

5. составить уравнения равновесия статики для произвольной плоской системы сил таким образом и в такой последовательности, чтобы решением каждого из этих уравнений было определение одной из неизвестных реакций опор;

6. проверить правильность найденных опорных реакций по уравнению, ĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ не было использовано для решения задачи.

Пример 2. Определить реакции опор балки (рис. 2, а).

1. Изобразим балку с действующими на нее нагрузками (рис.2,а).

2. Изображаем оси координат х и у.

3. Силу F заменяем ее составляющими F_x=F·cosα и F_y= F·sinα. Равнодействующая qCD равномерно распределенной нагрузки, приложенная в точке пересечения диагоналей прямоугольника (рис. 2, б), переносится по линии своего действия в середину участка CD, в точку К.

4. Освобождаем балку от опор, заменив их опорными реакциями (рис. 2, в).

5. Составляем уравнения равновесия статики и определяем неизвестные реакции опор.

а) Из уравнения суммы моментов всех действующих на балку сил, составленного относительно одной из точек опор, сразу определяем одну из неизвестных вертикальных реакций:

б) Определяем другую вертикальную реакцию:

в) Определяем горизонтальную реакцию:

6. Проверяем правильность найденных результатов:

Условие равновесия ΣYi = 0 выполняется, следовательно, реакции опор найдены верно.

Задачи 11 — 20. Определить реакции опор двухопорной балки (рис. 5). Данные своего варианта взять из табл. 3.

Таблица 3.

Продолжение табл. 3

Механика материалов: кручение »Механика тонких конструкций

Деформация при кручении

Крутящий момент — это момент, который скручивает структуру. В отличие от осевых нагрузок, которые создают равномерное или среднее напряжение по поперечному сечению объекта, крутящий момент создает распределение напряжения по поперечному сечению. Для простоты мы сосредоточимся на структурах с круглым поперечным сечением, часто называемых стержнями или валами.Когда к конструкции приложен крутящий момент, она будет закручиваться по длинной оси стержня, а ее поперечное сечение остается круглым.

Чтобы представить себе, о чем я говорю, представьте, что поперечное сечение стержня представляет собой часы с часовой стрелкой. Когда крутящий момент не прикладывается, часовая стрелка находится в положении «12 часов». Когда к стержню прилагается крутящий момент, он будет вращаться, и часовая стрелка повернется по часовой стрелке в новое положение (скажем, на 2 часа). Угол между 2 и 12 часами называется углом поворота и обычно обозначается греческим символом phi .Этот угол позволяет определить деформацию сдвига в любой точке поперечного сечения.

Прежде чем мы углубимся в детали этого уравнения, важно отметить, что, поскольку мы обсуждаем только круглых сечений , мы перешли с декартовых координат на цилиндрические. Отсюда и возник греческий символ rho — он обозначает расстояние по поперечному сечению, где rho = 0 в центре и rho = c на внешнем крае стержня.

Мы можем сразу узнать несколько вещей из этого уравнения. Первое, что может быть очевидным: чем больше угол скручивания, тем больше деформация сдвига (как и раньше, обозначается греческим символом gamma ). Во-вторых, и в этом большая разница между осевыми нагруженными конструкциями и нагруженными крутящим моментом, деформация сдвига неоднородна по поперечному сечению. Он равен нулю в центре скрученного стержня и имеет максимальное значение на краю стержня. Наконец, чем длиннее стержень, тем меньше деформация сдвига.

Пока что мы сосредоточили наше внимание на смещениях и деформациях. Чтобы обсудить напряжение внутри скрученного стержня, нам нужно знать, как соотносятся крутящий момент , и напряжение , напряжение . Поскольку скручивание вызывает деформацию сдвига, мы ожидаем, что крутящий момент будет прикладывать напряжение сдвига . Взаимосвязь между крутящим моментом и напряжением сдвига подробно описана в разделе 5.2 вашего учебника, и это приводит к следующему соотношению:

В этом уравнении J обозначает второй полярный момент площади поперечного сечения.Иногда это называют «вторым моментом инерции», но поскольку это уже имеет хорошо установленное значение в отношении динамического движения объектов, давайте не будем здесь путать вещи. Мы обсудим моменты площади более подробно позже, но они принимают очень простую форму для круглых поперечных сечений:

(Примечание: это одно и то же уравнение — твердые стержни имеют внутренний радиус c _i = 0).

Теперь у нас есть уравнения для нашей деформации сдвига и напряжения сдвига, все, что осталось сделать, это использовать закон Гука для сдвига, чтобы увидеть, как они связаны.Закон Гука позволяет нам записать красивое уравнение для угла скручивания — очень удобную вещь для измерения в лаборатории или в полевых условиях.

И, как мы видели для осевых смещений , мы можем использовать суперпозицию для наших сдвиговых деформаций :

Это окончательное уравнение позволяет разделить крутящие моменты, приложенные к разным частям одной и той же конструкции. Давайте решим проблему и посмотрим, понимаем ли мы, что происходит с крутильными деформациями.

Трансмиссия

Одним из наиболее распространенных примеров кручения в инженерном проектировании является мощность, генерируемая трансмиссионными валами. Мы можем быстро понять, как скручивание генерирует мощность, просто выполнив простой анализ размеров. Мощность измеряется в единицах Вт [Вт] , а 1 Вт = 1 Н · м · с ^-1. В начале этого раздела мы отметили, что крутящий момент представляет собой крутящую пару, что означает, что он имеет единицы силы, умноженные на расстояние, или [Н · м].Итак, при осмотре, чтобы генерировать мощность с крутящим моментом, нам нужно что-то, что происходит с заданной частотой f , поскольку частота имеет единицы Герц [Гц] или [s ^-1]. Таким образом, мощность на оборот (2 * пи) круглого стержня равна приложенному крутящему моменту, умноженному на частоту вращения, или:

В крайней правой части уравнения мы использовали соотношение, согласно которому угловая скорость, обозначаемая греческой буквой омега , равна частоте, умноженной на 2pi.

Статически неопределимые задачи

Одно уравнение, два неизвестных… мы шли по этому пути, прежде чем понадобилось что-то еще. Хотя тип нагружения и деформации различны, к статически неопределенным задачам , связанным с кручением стержней, подходят точно так же, как и с осевыми нагруженными конструкциями. Начнем со схемы свободного тела скрученного стержня. Возьмем, к примеру, стержень на рисунке ниже, застрявший между двумя стенами.

Сразу после осмотра вы должны заметить, что стержень прикреплен к двум стенкам, тогда как для статического равновесия требуется только одна. Больше опор, чем необходимо: статически неопределимых . Статическая неопределенность означает: нарисуйте диаграмму свободного тела, просуммируйте силы в направлении x —, и вы получите одно уравнение с двумя неизвестными силами реакции. Итак, нам нужно учитывать наши деформации — для кручения это означает, что давайте обратимся к нашему уравнению, которое описывает суперпозицию углов закручивания.Для этого уравнения следует отметить, что половина стержня сплошная, а другая половина — полая, что влияет на то, как мы вычисляем Дж, для каждой половины. Самое главное, мы должны спросить себя: «Что мы знаем о деформации?» Ну, так как стержень прилипает к стене краем, скручивание в точках A, и B должно быть равно нулю (точно так же, как смещение в последнем разделе). Посмотрите, сможете ли вы решить остальную проблему самостоятельно: каков крутящий момент в каждой половине стержня?

(ответ: T _a = 51.7 фунт-футов & T _b = 38,3 фунт-футов).

Сводка

В этом уроке мы узнали о крутящем моменте и торсионном . Этот другой тип нагрузки создает неравномерное распределение напряжений по поперечному сечению стержня — от нуля в центре до максимального значения на краю. На основе этого анализа мы можем установить взаимосвязь между углом скручивания в любой точке вдоль стержня и деформацией сдвига внутри всего стержня.Используя закон Гука, мы можем связать , эту деформацию с напряжением внутри стержня. Мы также использовали метод размерного анализа для определения мощности, генерируемой трансмиссионным валом (т. Е. Стержнем), который вращается с заданной частотой под приложенным крутящим моментом. Наконец, мы показали, что проблемы кручения также часто являются статически неопределенными , и даже несмотря на то, что нагрузка и деформация различаются, метод, который мы установили в последнем разделе для решения задач с осевой нагрузкой, является тем же методом для решения проблем с крутящим моментом.

Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом в рамках гранта № 1454153. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда. Научный фонд.

Определение базальной активности фосфодиэстеразы в фоторецепторах палочек мышей с помощью зажима cGMP

Экспериментальное

Этическое разрешение

Использование и обращение с животными соответствовали Закону об экспериментах на животных 2006 г. и руководящим принципам Совета по экспериментам на животных Финляндии.Протоколы экспериментов были одобрены Центром лабораторных животных Хельсинкского университета и Экспериментальным советом на животных Финляндии. Кроме того, Совет по генным технологиям Финляндии одобрил нашу лабораторию для использования мышей, подвергшихся генетической манипуляции.

Животные и препараты

Дикий тип (C57BL / 6J), GCAP ^{— / —} и GCAP ^{— / —} восстанавливаются у мышей ^{— / —} с двойным нокаутом (DKO), полученные из GCAP ^{— / —} и восстановить на ^{— / —} мышах ⁴², любезно предоставленных Dr.Джинни Чен (Университет Южной Калифорнии) использовались в этом исследовании. Мышей адаптировали к темноте в течение ночи и умерщвляли путем ингаляции CO ₂ с последующим смещением шейки матки. Глаза были удалены, и были сделаны небольшие разрезы по экватору глаз. Глаза разделяли пополам, увеличивая разрез микроножницами, и изолированный наглазник помещали в охлажденную питательную среду (состав описан в камере для записи, записях и перфузионной секции). Один наглазник хранили при +7 ° C в питательной среде в светонепроницаемом контейнере для использования позже в тот же день.Сетчатку удаляли из наглазника с помощью щипцов и микроножниц под микроскопом, и всю сетчатку помещали в держатель для образцов в светонепроницаемую клетку Фарадея. Описанные выше процедуры были выполнены при тусклом красном свете.

Регистрирующая камера, записи и перфузия

Наш держатель образца позволяет одновременно визуализировать, стимулировать и перфузию сетчатки, и он оснащен открытым проходом для микроэлектродов, позволяющим проводить локальную электроретинографическую запись. ⁴⁷.Локальная электроретинография (LERG) регистрировалась через слой внешнего сегмента стержня (LERG-OS) или через все фоторецепторы (LERG-PR). Сигнал LERG-OS прямо пропорционален изменениям тока внешнего сегмента стержня ⁴⁷. Регистрирующий электрод (с диаметром острия ∅ 2–5 мкм) пропускался на глубину ~ 25 мкм (OS) или ~ 100 мкм (PR) в сетчатке, и электрод сравнения (острие ~ 30 мкм) располагался в сетчатке. на поверхности сетчатки. Поверхность идентифицировали как визуально, так и по сдвигу напряжения, наблюдаемому, когда регистрирующий электрод проникал через поверхность сетчатки.Во время записи LERG проводились одновременные трансретинальные записи ERG с макроэлектродами, расположенными с обеих сторон сетчатки. Геометрия записи более подробно описана в ⁴⁷.

Открытая камера держателя образца была заполнена питательной средой, и ламинарный поток среды перфузировал фоторецепторную сторону сетчатки с постоянной скоростью ( ~ ,3 мл / мин). Состав питательной среды (мМ): Na ⁺, 133,4; К ⁺, 3.3; Mg ²⁺, 2,0; Ca ²⁺, 1,0; Cl ^—, 143,2; глюкоза 10,0; ЭДТА 0,01; HEPES, 12,0, доводят до pH 7,5 с помощью 5,8 мМ NaOH. Жизнеспособность сетчатки была улучшена путем добавления к раствору 0,72 мг / мл культуральной среды Лейбовица L-15. Синаптическая передача от фоторецепторных клеток к биполярным клеткам блокировалась добавлением 2 мМ аспартата натрия ⁴⁸. Чтобы устранить глиальный компонент, возникающий из клеток Мюллера, к питательной среде ^48,49 добавляли 50 мкМ BaCl ₂.3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) использовали в качестве ингибитора PDE в концентрациях 5, 10, 20 и 40 мкМ. Все химические вещества были закуплены у Sigma-Aldrich (Эспоо, Финляндия).

Держатель образца помещали наверху теплообменника, температуру которого можно было контролировать с помощью водяной циркуляционной нагревательной бани (LTD6G; Grant Instruments Ltd, Шепрет, Ройстон, Великобритания). Запись велась при физиологической температуре 37 ± 1 ° C. Температура питательной среды вблизи сетчатки постоянно контролировалась калиброванным термистором (30K6A309I; BetaTHERM; Measurement Specialties, Inc., Хэмптон, Вирджиния, США).

Световая стимуляция

Световая стимуляция осуществлялась с помощью вспышек в течение 1 мс от светодиодного источника света (Luxeon Rebel LXML-PM01-0100, λ _max = 532 нм; Lumileds, Амстердам, Нидерланды). Стимулы равномерно освещали всю сетчатку, что подтверждалось профилировщиком луча на основе камеры (Spiricon Laser Beam Diagnostics Model SP503U). Абсолютная интенсивность света, падающего на сетчатку, измерялась калиброванным фотодиодом (Thorlabs GmbH FDS100-cal).Количество изомеризаций родопсина (R * стержень ^-1 или R * стержень ^-1 с ^-1), вызванных стимулом, было рассчитано на основе спектров светодиода и фотодиода, соответственно, и пигментного шаблона Говардовским и др. . (2000), как описано в Heikkinen et al . ⁵⁰.

Пропорционально-интегрально-производная (PID) управляемая обратная связь с обратной связью от записанного сигнала напряжения ERG к источнику света была разработана для того, чтобы поддерживать постоянный записанный сигнал, когда ингибитор PDE был введен в сетчатку.Обратная связь по управлению освещением осуществлялась в цифровом виде с помощью LabVIEW (National Instruments, Остин, Техас, США).

Сбор данных

Сбор данных и управление светодиодами осуществлялись с помощью карты сбора данных (PCIe-6351; National Instruments) и специального программного обеспечения LabVIEW. Записанный сигнал постоянного тока был дискретизирован с частотой 1000 Гц с разрешением по напряжению 15 нВ и усилен в 1000 раз. Сигналы подвергались фильтрации нижних частот при f _c = 500 Гц (8-полюсный фильтр Бесселя), а затем в цифровом виде при f _c = 100 Гц.{2 +})) cGMP (t), \ end {array} $$

(2)

, где R ^* — количество активных молекул родопсина, PDE ^* — количество активных субъединиц PDE, Φ _BG — количество активированных молекул родопсина в секунду в одном стержне при фоновом освещении [ Φ _BG] = R * стержень ⁻¹ с ⁻¹, k _R и k _E — константы скорости для родопсина и деактивация PDE. α — скорость синтеза цГМФ, а β — константа скорости гидролиза цГМФ. β _темный и β _{светлый} — константы скорости гидролиза цГМФ базально активными и активируемыми светом PDE, соответственно. β _sub — константа скорости гидролиза для одной субъединицы PDE ^*, а ν _RE — константа скорости активации PDE активированным родопсином.{\ ast} = \ frac {\, {\ nu} _ {RE}} {{k} _ {E} {k} _ {R}} {{\ Phi}} _ {BG} \\ \ frac { dcGMP (t)} {dt} = 0 \ Rightarrow \ alpha — ({\ beta} _ {dark} + {\ beta} _ {sub} \ frac {\, {\ nu} _ {RE}} {{k } _ {E} {k} _ {R}} {{\ Phi}} _ {BG}) cGMP = 0 \ end {array} $$

(3)

Введение конкурентного ингибитора ФДЭ снижает среднюю константу скорости гидролиза цГМФ с β до β _I согласно

$$ {\ beta} _ {I} = k ([I] ) \ beta = \ frac {\ beta} {1+ \ frac {[I]} {{K} _ {I}}} $$

(4)

, где β _I — константа скорости гидролиза цГМФ в присутствии ингибитора ФДЭ, [ I ] — концентрация ингибитора, k ([ I ]) — функция, описывающая действие ингибитора, а K _I — константа ингибирования для ингибитора.

Ингибиторы ФДЭ снижают скорость гидролиза цГМФ, тогда как свет увеличивает ее. Снижение базовой активности ФДЭ из-за ингибитора может быть компенсировано увеличением света. Для устойчивого состояния при отсутствии света и ингибитора

$$ {\ alpha} _ {dark} — {\ beta} _ {dark} cGM {P} _ {dark} = 0. $$

(5)

В присутствии ингибитора ФДЭ и света

$$ \ alpha -k ([I]) ({\ beta} _ {dark} + {\ beta} _ {sub} \ frac {\, {\ nu } _ {RE}} {{k} _ {E} {k} _ {R}} {{\ Phi}} _ {BG}) cGMP = 0.$$

(6)

Мы предполагаем, что, когда сигнал фоторецептора поддерживается постоянным за счет увеличения интенсивности фонового света во время введения ингибитора ФДЭ, концентрация цГМФ в стержнях не изменяется. Таким образом, уровень внутриклеточного кальция, а также скорость синтеза и гидролиза цГМФ остаются ограниченными до темновых значений. Соотношение, позволяющее определить базальную активность ФДЭ β _темный, можно получить, установив концентрации цГМФ равными в уравнениях 5 и 6:

$$ \ begin {array} {rcl} {\ alpha} _ {dark} — {\ beta} _ {dark} cGMP & = & {\ alpha} _ {dark} -k ([I]) ({\ beta} _ {dark} + {\ beta} _ {sub} \ frac {\, {\ nu} _ {RE}} {{k} _ {E} {k} _ {R}} {{\ Phi}} _ {BG}) cGMP \\ & \ iff & {\ beta } _ {sub} \ frac {\, {\ nu} _ {RE} {K} _ {I}} {{k} _ {E} {k} _ {R}} {{\ Phi}} _ { BG} = {\ beta} _ {темно} [I].\ end {array} $$

(7)

Константа усиления A определяется как

$$ A = {\ nu} _ {RE} {\ beta} _ {sub} {n} _ {cGMP}, $$

(8)

, где n _cGMP = 3 — коэффициент Хилла ^2,5, представляющий кооперативность сайтов связывания cGMP в каналах CNG ²¹. Отсюда мы можем упростить уравнение (7), применив константу усиления и заменив константы скорости реакции дезактивации родопсина и PDE средним временем жизни \ ((\ tau = \ frac {1} {k}) \)

$ $ {{\ Phi}} _ {BG} \ frac {A {\ tau} _ {R} {\ tau} _ {E}} {{n} _ {cGMP}} = {\ beta} _ {dark} \ frac {[I]} {{K} _ {I}}.$$

(9)

Стоит отметить, что левая часть уравнения (9) соответствует активности PDE, возникающей в результате световой стимуляции в условиях без ингибитора PDE. Таким образом, уравнение можно представить в виде

$$ {\ beta} _ {light} = {\ beta} _ {dark} \ frac {[I]} {{K} _ {I}}. $$

(10)

Однако, если эффективность ингибитора в отношении светоактивированного и базально активированного ФДЭ ( K _{I , темный} и K _{I , светлый}) различается, уравнение (10) принимает вид

$$ {\ beta} _ {light} = {\ beta} _ {dark} \ frac {1+ \ frac {[I]} {{K} _ {I, light}}} {1 + \ frac {{K} _ {I, темно}} {[I]}}.$$

(11)

Уравнение (9) можно использовать для определения β _{темного} из линейной аппроксимации экспериментальных данных, где Φ _BG получают для каждой концентрации ингибитора [ I ] с использованием зажим cGMP.

Моделирование откликов на вспышку

Фототрансдукция хорошо охарактеризована на молекулярном уровне, а оценки констант скорости подтверждены биохимическим и электрофизиологическим анализом ^2,3,51.Современные модели фототрансдукции стремятся учесть все известные реакции фототрансдукции ^52,53. Это, в принципе, позволяет точно моделировать фотоотклики в различных условиях, но на практике приводит к огромному количеству свободных параметров. В этом исследовании мы использовали модель с минимальным количеством параметров, игнорируя механизмы кальциевой обратной связи в фототрансдукции и упрощая реакционные цепочки до реакций первого порядка, когда это возможно. Аналогичная модель представлена и подробно объяснена в ².{2 +})}}, $$

(12)

, где Φ — количество активированных родопсинов, продуцируемых вспышкой стимула, а τ _R — среднее время жизни активированных родопсинов. Белок, связывающий кальций, реэктин, изменяет τ _R кальций-зависимым образом ^54,55. Активированные родопсины могут активировать G-белки, трансдуцины, с которыми они сталкиваются. {2 +} \,)) cGMP (t).$$

(15)

У мышей GCAP ^{— / —}, Ca ²⁺-зависимая модуляция синтеза цГМФ удалена и Δ α ( t , Ca ²⁺) = 0. В GCAP ^{— / —} восстанавливается у мышей ^{— / —}, также можно не принимать во внимание опосредованную кальцием модуляцию продолжительности жизни родопсина. Для мышей DKO уравнение (15) упрощается до вида

$$ \ frac {dcGMP (t)} {dt} = {\ alpha} _ {dark} — ({\ beta} _ {dark} + {\ beta} _ {light} (t)) cGMP (t) $$

(16)

В течение короткого времени после импульсного стимула скорость изменения цГМФ определяется скоростью гидролиза цГМФ с помощью светоактивированной ФДЭ (- β _свет ( t ) cGMP ( t )), который превосходит комбинированные эффекты от скорости устойчивого синтеза цГМФ ( α _темный = β _темный цГМФ _темный) и базальной скорости гидролиза цГМФ ( — β _темный cGMP ( т )).Математически это можно сформулировать как: β _{светлый} ( t ) cGMP ( t ) ≫ β _темный ( cGMP _темный — cGMP ( т )). Применение соотношения к уравнению (16) приводит к

$$ \ frac {dcGMP (t)} {dt} = — \, {\ beta} _ {light} (t) cGMP (t). $$

(17)

В сочетании с уравнениями (13 и 14) уравнение (17) может использоваться для моделирования фазы активации фототрансдукции.{{n} _ {cGMP}}}. $$

(18)

Здесь J _cG обозначает ток через CNG-каналы, а J _{cG , max} обозначает максимальный ток, когда все каналы CNG открыты. Концентрация цГМФ, приводящая к половине максимального открытия канала, K _цГМФ, в естественных условиях всегда значительно превышает уровень цГМФ ².{{n} _ {cGMP}}, $$

(19)

, где cGMP _темный — это концентрация cGMP в адаптированном к темноте состоянии, а J _темный — соответствующее значение циркулирующего темнового тока через каналы CNG. В области внешнего сегмента стержней циркулирующий ток Дж ( t ) следует омической связи с падением напряжения во внеклеточном пространстве на внешних сегментах стержня, r ( t ), что является сигналом, зарегистрированным в LERG на уровне внешнего сегмента (LERG-OS) ^47,56.{{n} _ {cGMP}}. $$

(20)

В этой модели уравнения 16 и 17 решаются численно с помощью Matlab. Модель предполагает, что 1) внешние сегменты хорошо перемешаны, то есть нет градиентов концентрации в различных клеточных компартментах, и 2) концентрации белка существенно не меняются во время фотоответа. Уравнение (16), использующее модель, использовалось для моделирования полных откликов на тусклую вспышку GCAP ^{— / —} и мышей DKO.Кроме того, мы определили константы амплификации и время жизни родопсина для мышей WT, GCAP ^{— / —} и DKO путем подгонки модели с использованием уравнения (17) к началу фаз активации мгновенного ответа, где модуляция, опосредованная кальцием, все еще может считаться незначительной. .

Определение всех размеров наностержней CdS с засеянным CdSe исключительно с помощью их УФ / видимого спектра .В деталях, диаметр сердцевины, а также общий диаметр и длина, а также молярный коэффициент экстинкции могут быть получены из характеристических точек в спектрах поглощения. Мы тщательно исследуем, в каком режиме размера наши предположения верны, и даем оценку ожидаемой ошибки, позволяя читателю решить, является ли этот метод достаточно точным для соответствующей системы. Наш метод показывает удобный и быстрый способ анализа этих часто используемых в настоящее время наностержней.

1 Введение

Полупроводниковые наночастицы в настоящее время представляют собой широко исследуемый класс материалов. Их уникальные свойства делают их интересными кандидатами для фундаментальных исследований, а также для различных приложений (например, солнечные элементы, светодиоды, фотокатализ и т. Д.) [1]. Синтез этих наночастиц методом так называемой «горячей инъекции» является предпочтительным из-за хорошего контроля их формы, размера и состава при низкой степени полидисперсности. С помощью метода горячего инжекции доступно большое количество полупроводниковых наночастиц.Таким образом, начиная с 0-мерных квантовых точек (однородных [2], а также гетерогенных квантовых точек ядро / оболочка [3], [4]), одномерных однородных [5] и гетерогенных наностержней [6], [7], [8] и –провода, двумерные нанопластинки [9], [10] и даже различные разветвленные наночастицы, такие как тетра- [11], [12], [13] и октаподы [14], могут быть синтезированы сегодня.

В этой статье мы сконцентрируемся на наностержнях CdS с засеянным CdSe. Эти наночастицы представляют особый интерес из-за их высокой квантовой эффективности фотолюминесценции (ФЛ) [11].На основе этих частиц многие группы исследуют дальнейшие эффекты, такие как реакции катионного обмена, [15], [16] реакции фазового перехода [17] и образование сверхструктур [18]. Также многие исследователи исследовали рост металла на этих структурах [19].

Это лишь несколько примеров использования наностержней CdS с затравкой из CdSe в недавней литературе. Почти каждое исследование, начинающееся с наностержней CdS с засеянным CdSe, в первую очередь основывается на определении размеров гетеронаностержней и их концентрации в коллоидной суспензии.До сих пор только сочетание методов визуализации, таких как просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), и количественного анализа, такого как атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС), приводило к полному пониманию размеров наночастиц CdS, засеянных CdSe.

Для сферических квантовых точек халькогенида Cd определение размера легко сделать, потому что на основе квантового размерного эффекта размер и концентрация могут быть рассчитаны по первому максимуму поглощения спектра с помощью эмпирических уравнений [20], [21], [22] ].Для удлиненных наностержней из чистого CdSe аналогичные исследования показали, что их диаметр можно рассчитать по первому максимуму экстинкции, в то время как при известной концентрации частиц высокоэнергетическое поглощение (например, при 350 нм) можно соотнести с общим объемом наностержней, что в конечном итоге приводит к информации о длине стержня [23]. Сферические засеянные CdSe квантовые точки CdS также были исследованы в этом направлении, и здесь толщина оболочки CdS коррелировала со смещением первого максимума поглощения ядра CdSe (для достаточно тонких оболочек CdS) [24].В гетероструктурах, состоящих из CdSe и CdTe, также было показано, что независимо от формы частиц коэффициент экстинкции увеличивается пропорционально добавленному количеству материала оболочки [25]. Позже это было детально исследовано, показав, что вплоть до третьего, с каждым добавленным монослоем CdS первая полоса поглощения ядра CdSe смещается, а затем остается постоянной [26].

Чтобы иметь возможность определить все размерные параметры наностержней CdS с затравкой CdSe по их УФ-видимым спектрам, нам сначала необходимо сопоставить смещенные запрещенные зоны CdSe с исходными размерами затравок.На следующем этапе мы должны найти способ определить ширину и длину наностержней. Наконец, найдя правильное соотношение между объемами частиц и их коэффициентами экстинкции, мы можем затем вычислить концентрацию частиц и, следовательно, также концентрацию Cd.

В этой статье мы демонстрируем, что можно получить все необходимые размеры исключительно из спектров экстинкции частиц.

2 Результаты и обсуждение

В следующей части мы проанализируем спектры поглощения в УФ и видимой областях гетерогенных наностержней CdS с затравкой CdSe, чтобы показать, что на их основе можно получить всю необходимую информацию.Начиная с части с низкой энергией (высокие длины волн) и переходя к более высоким энергиям (меньшие длины волн), мы рассмотрим четыре конкретные области более подробно (см. Рисунок 1).

Рис. 1:

(вверху) Типичный спектр экстинкции наностержней CdS с затравкой CdSe с отмеченными точками интереса, из которых мы можем определить их размер и концентрацию. На вставке показано увеличение максимума экстинкции затравки CdSe. (внизу) Схема наностержня CdS с засеянным CdSe с диапазоном параметров размера, который может быть рассчитан с допустимой погрешностью с помощью метода, представленного в этой статье.

Мы начнем с первого небольшого локального максимума экстинкции (обычно между 550 и 650 нм), за который отвечает ядро наностержня CdSe. Положение этого пика коррелирует с размером ядра CdSe. Ширина наностержней CdS с засеянным CdSe определяется по положению пересечения касательной через точку перегиба низкоэнергетической стороны полосы поглощения, связанной с CdS, с осью x. Пиковое значение экстинкции той же полосы связано с объемом наностержней, и в результате расчетов предположение о цилиндрической форме приводит к длине наностержней.Наконец, было обнаружено, что коэффициент экстинкции около 350 нм более или менее не зависит от размеров стержней и зависит только от общей концентрации материала и, таким образом, может использоваться для определения концентрации частиц, когда размеры частиц известны. Подробный анализ данных, полученных для каждой из этих точек, представлен в следующих параграфах.

Наностержни

CdSe с затравкой CdS были синтезированы в соответствии с процедурой, разработанной группой Manna, путем сначала синтеза затравок CdSe с помощью метода горячего впрыска, а затем синтеза стержней CdS с затравками CdSe с помощью метода опосредованного роста семян (см. Экспериментальный раздел и дополнительную информацию для получения подробной информации. ) [8].Наиболее доступными типами частиц являются короткие и толстые наностержни с темно-красным цветом и высокими квантовыми выходами фотолюминесценции (PL QY). Они синтезируются с использованием больших затравок CdSe, которые легче производить из-за более длительного времени реакции. Более длинные и более узкие наностержни синтезируются с небольшими затравками CdSe. Их можно получить путем очень быстрого прекращения синтеза затравки CdSe при не таких высоких температурах реакции, как у крупных затравок. Для получения наностержней, которые являются толстыми, а также длинными или тонкими и короткими, параметры реакции синтеза наностержней должны быть немного изменены.Для толстых и длинных наностержней необходимо значительно увеличить количество CdO, для тонких и коротких наностержней — уменьшить. На рисунке 2 показаны обзорные ПЭМ-изображения четырех репрезентативных образцов наностержней. На панели A показаны наностержни средней длины и ширины, на панели B мы можем видеть сильно вытянутые наностержни, тогда как на панели C представлены очень короткие и толстые наностержни. Наконец, на панели D показаны толстые наностержни средней длины. Эти четыре образца также представляют ограничения этого синтетического пути.На панелях A и C показаны образцы, которые легко доступны, просто варьируя размер затравки CdSe и выход при высокой монодисперсности. На панели B мы уже видим, что удлиненные частицы имеют тенденцию отламываться более мелкие, а также терять свою прямолинейность. На панели D можно увидеть пример толстых наностержней, которые были синтезированы с использованием более высоких количеств прекурсоров. Рост CdS происходит в этих частицах неоднородно, что приводит к неравномерной толщине по длине. Всего мы проанализировали 35 образцов наностержней CdS с затравкой CdS различной ширины и длины, которые были синтезированы из девяти различных размеров сердцевины CdSe.Типичный УФ-видимый спектр наностержней, полученный с помощью этой процедуры, показан на рисунке 1. Теперь мы перейдем к более глубокому анализу этих спектров.

Рис. 2:

ПЭМ-изображения четырех типичных образцов наностержней CdS с засеянным CdSe, демонстрирующие тонкие и короткие наностержни (панель A), тонкие и длинные наностержни (панель B), толстые и короткие наностержни (панель C), а также толстые и длинные наностержни. (Панель D).

Начиная с первой значимой точки в спектре, самого низкого максимума поглощения энергии, на Рисунке 3 показано, что этот небольшой пик в области низких энергий спектра существенно зависит от диаметра сердцевины CdSe.Более ранние исследования показывают, что в сферических квантовых точках CdS с засеянным CdSe полоса CdSe нижележащих зародышей смещается в сторону более низких энергий с каждым добавленным монослоем оболочки до трех монослоев. В дальнейшем положение полосы CdSe остается почти постоянным [24]. В случае анизотропных наностержней CdS с засеянным CdSe частицы покрываются фосфоновыми кислотами во время синтеза наностержней для облегчения роста вдоль оси c за счет блокировки боковых граней частиц.Это приводит к образованию толстой оболочки вдоль оси наностержня. Но ширина наностержней просто увеличивается до 2 нм, что соответствует примерно трем монослоям CdS. Соответственно, мы обнаруживаем, что положение низкоэнергетического перехода лишь незначительно зависит от вариаций ширины стержней (и, следовательно, толщины оболочки из CdS, перпендикулярной оси стержней), что можно видеть по относительно небольшому разбросу положений пиков. засеянных стержней с аналогичными диаметрами керна (черные точки на нижней панели Рисунка 3).Особенно это видно на рисунке 3 (нижняя панель), что уже для чистых семян CdSe отклонение диаметров семян от подгоночной кривой типа Брюса довольно велико (и особенно выше, чем дисперсия между положением сигналов поглощения для засеянных стержней. с таким же диаметром затравки), что, вероятно, вызвано неточностями в определении диаметра частиц по изображениям ПЭМ. Следовательно, мы заключаем, что исходный диаметр семян может быть извлечен из положения сигнала наименьшего поглощения энергии с достаточно высокой точностью (например,грамм. не менее точен, чем, например, с помощью ПЭМ-измерений исходных семян). Однако с практической точки зрения определение диаметра семян по спектрам засеянных стержней часто не требуется, поскольку диаметр ядра семян, конечно, обычно легче определить по спектру поглощения исходных семян. Следовательно, предлагаемый здесь метод будет необходим только тогда, когда исходные семена недоступны.

Рис. 3:

(вверху) Примерные спектры поглощения наностержней CdS с затравкой CdSe с различными диаметрами сердцевины CdSe в спектральном диапазоне от 550 до 625 нм.(внизу) График зависимости диаметра сердцевины CdSe от положения пика связанной с CdSe полосы поглощения всех исследованных наностержней CdS с засеянным CdSe (черные точки). Положения пиков поглощения исходных семян CdSe (красные точки). Линии показывают соответствующие подгоночные кривые, полученные с помощью уравнения Бруса (подробности извлеченных подгоночных параметров (которые в принципе коррелируют с эффективными массами и диэлектрической проницаемостью материала) показаны во вспомогательной информации, рис. SI 1 и его обсуждении).Ошибки варьируются от 0,4 до 0,7 нм в зависимости от качества изображений ПЭМ, на которых основывались измерения.

На следующем этапе мы определим общую ширину наностержней. Особенно для более широких стержней не может быть обнаружен отчетливый максимум поглощения в том месте спектра, где CdS начинает поглощать, но можно идентифицировать только более или менее выраженное плечо. Мы обнаружили, что пересечение касательной через точку перегиба низкоэнергетической стороны полосы поглощения, связанной с CdS (которая также может быть построена для полос поглощения плечевого типа) с осью x спектра поглощения, позволяет определить ширина штанги.Поскольку ширина является гораздо более сильным ограничивающим размером наностержней, положение вышеупомянутого пересечения изменяется из-за квантования размера для наностержней разной толщины.

Эта калибровочная кривая позволяет определять ширину наностержней CdS с затравкой CdSe с приемлемой точностью в диапазоне ширины 4–7 нм. Экстраполяция для более тонких стержней должна быть легко возможной, что, однако, почти не может быть реализовано синтетически. Также возможна экстраполяция для более толстых стержней, но они также не являются легко доступными синтетически, а также квантование размера становится все слабее и слабее с увеличением толщины, и поэтому определение ширины становится все менее и менее точным для более толстых стержней.Следует также отметить, что особенно для очень длинных стержней иногда получаются стержни с неоднородной толщиной по всей длине стержня, которые, естественно, не могут быть проанализированы этим методом.

На рисунке 5 мы показываем зависимость объемного отношения между CdSe и CdS от отношения значений экстинкции соответствующих полос поглощения. В случае толстых и коротких наностержней полоса CdS не показывает отчетливого максимума. Здесь пересечение касательной в точке перегиба полосы CdS с касательной, экстраполированной со стороны высокоэнергетической полосы, используется в качестве значения экстинкции.Эти два соотношения можно приблизительно подогнать с помощью линейной посадки. Подгоночное линейное уравнение:

(1) VCdsVCdse = 1,337ECdsECdse,

, что указывает на молярный коэффициент экстинкции CdSe, который в 1,34 раза выше, чем для CdS.

Поскольку объем ядра CdSe уже известен, можно рассчитать объем CdS и, следовательно, общий объем наностержня. Вместе с шириной наностержня, длина также становится доступной, если принять в качестве хорошего приближения цилиндрическую форму стержня.Следовательно, на данный момент мы знаем все размеры наностержней CdS с затравкой CdSe. Следует отметить, что последний упомянутый шаг возможен только в наностержнях CdS с затравкой CdSe, а не, например, в чистые наностержни CdS (для последних определение длины только по спектру поглощения было бы невозможно).

На нижней панели рисунка 4 заметно, что есть некоторые точки данных, сильно отклоняющиеся от аппроксимации. Длинные наностержни, особенно когда они синтезированы с крупными затравками CdSe, имеют сильную тенденцию иметь неоднородную толщину по длине.Наблюдались два типа поведения. В одном случае наностержни становятся тоньше к концу, что приводит к образованию большего количества конусов, чем наностержней цилиндрической формы. Это искажает объемное отношение CdS / CdSe к более высоким значениям. В противном случае частицы в средней части уже, чем на концах. Малая ширина этих узких средних частей измеряется как общая ширина наностержней, поэтому объемное соотношение CdS / CdSe искажено до более низких значений. Оба типа вывода снова показывают, что наш метод, естественно, охватывает только такие засеянные стержни с однородной шириной стержня, как мы уже наблюдали при определении ширины стержня.

Рис. 4:

(вверху) Типичные спектры экстинкции наностержней CdS с затравкой CdSe. (внизу) График пересечения касательных через точки перегиба нижней энергетической стороны всех полос CdS в зависимости от измеренной ширины наностержней. Линия получается путем подбора типа Брюса по всем точкам данных (подробности подгонки см. В вспомогательной информации на рис. SI 2.

Наконец, когда известны все размеры наностержней, можно также рассчитать молярную концентрацию в растворе.Лучший способ сделать это — измерить значение экстинкции при высоких энергиях, например при 350 нм, поскольку уже было показано, что высокое поглощение энергии для гомогенных стержней более или менее не зависит от размеров стержня и зависит только от общего количества материала, присутствующего в растворе. На рис. 6 показана зависимость молярного коэффициента экстинкции на длине волны 350 нм от объема наностержня для всех исследованных образцов. Для наностержней CdS с затравкой CdSe мы обнаружили, что более или менее независимый от формы коэффициент экстинкции частиц на длине волны 350 нм составляет:

(2) ε = 28326.9Лмоль · см · нм3⋅V

где V — уже определенный общий объем стержня в нм [3]. Как уже было показано на рисунке 5 (нижняя панель), на рисунке 6 также есть некоторые точки данных, которые сильно отклоняются от линии тренда, показанной серыми точками данных. Снова мы можем видеть, что частицы, которые не являются однородными по своей форме, и образцы, которые не являются достаточно монодисперсными, не соответствуют аппроксимирующей линии. Чаще это происходит в наностержнях, которые синтезируются из крупных затравок CdSe, и они тоже имеют длину.

Рис. 5:

(вверху) Примерные спектры экстинкции наностержней CdS с затравкой CdSe, показывающие отношение поглощения полосы CdS около 450 нм по сравнению с поглощением полосы CdSe (см. Вставку), которая также используется для нормировки спектров. (внизу) График отношения экстинкции CdS и CdSe в зависимости от объемного отношения CdS и CdSe для всех наностержней. Серыми точками отмечены образцы, которые не соответствуют модели поведения из-за отсутствия монодисперсности и / или неоднородности частиц.

Рис. 6:

График коэффициента молярной экстинкции на длине волны 350 нм, рассчитанный с помощью комбинации результатов ПЭМ и ААС, в зависимости от общего объема наностержней. Линия показывает линейный фитинг. Серые точки показывают образцы, которые не соответствуют общей тенденции.

Если известен молярный коэффициент экстинкции, можно непосредственно рассчитать концентрацию частиц в растворе.

3 Заключение

Подводя итог, мы показали, что вся информация, касающаяся размера и концентрации наностержней CdS с затравкой CdSe, может быть получена только из их УФ-видимых спектров.Во-первых, диаметр сердцевины CdSe должен быть определен по самому низкому максимуму поглощения энергии с использованием калибровочной кривой, показанной на рисунке 3. Затем ширина стержня определяется положением полосы поглощения, связанной с CdS, с использованием калибровочной кривой с рисунка 4. общий объем стержня можно оценить по отношению максимальных значений экстинкции двух вышеупомянутых полос поглощения с помощью калибровочной кривой на рисунке 5. Как только все размеры известны, концентрация частиц может быть определена по оптической плотности при высокой энергии с помощью калибровочная кривая на рисунке 6.Наш метод работает с точностью, которая достаточно высока для определенных применений наностержней, пока они остаются в заданном режиме размера и пока их форма более или менее цилиндрическая. Это может позволить исследователям избежать затратного по времени и ресурсам ПЭМ-анализа, если требуется не слишком высокая точность.

4 Экспериментальная часть

4.1 Химический список

Оксид кадмия (CdO, 99,98%), селен (Se, 99,999%, 200 меш) и метанол (MeOH, 99,9%, безводный) были приобретены у Alfa Aesar.Приобретены соляная кислота (HCl, 37%), азотная кислота (HNO3,> 69%), Cd Standard для AAS (1000 мг / л в азотной кислоте), сера (S, 99,98%) и толуол (99,8%, безводный). от Sigma-Aldrich. Три-н-октилфосфин (TOP, 97%), три-н-октилфосфиноксид (TOPO, 99%) были приобретены в ABCR. Октадецилфосфоновая кислота (ODPA,> 99%) и гексилфосфоновая кислота (HPA,> 99%) были приобретены в PCI Synthesis.

4.2 Синтез затравок CdSe

Квантовые точки CdSe были синтезированы аналогично процедуре Manna et al.[8].

CdO (0,060 г), TOPO (3,0 г) и ODPA (0,280 г) дегазировали в вакууме при 150 ° C в течение 1 часа. Смесь нагревали до 300 ° C в атмосфере азота и впрыскивали 1,8 мл TOP. Затем смесь нагревали либо до 350 ° C, либо до 380 ° C, в зависимости от того, какой размер должен был быть достигнут (подробности см. В вспомогательной информации в таблице SI 8). В эту смесь вводили раствор 1,8 мл TOP и 0,058 г Se, который получали в атмосфере азота. Реакцию быстро гасили через 5–60 с, в зависимости от желаемого размера семян, путем инъекции 5 мл ТОР и использования водяной бани, а также через достаточное время добавлением 10 мл толуола.Полученные квантовые точки осаждали добавлением избытка метанола и центрифугированием при 3843 g. Квантовые точки повторно диспергировали в толуоле для хранения.

4.3 Синтез наностержней CdS с затравкой CdSe

Наностержни CdS с затравкой CdSe были синтезированы аналогично процедуре Manna et al. [8]. Следующее описание показывает типичный синтез наностержней. Всего было приготовлено 35 образцов. Для достижения различных размеров процедура была изменена путем изменения количества Cd, а также S-предшественников или времени реакции (подробности см. В вспомогательной таблице SI 9).В примерной реакции CdO (0,060 г), TOPO (3,0 г), ODPA (0,290 г) и HPA (0,080 г) дегазировали в вакууме при 150 ° C в течение 1 часа. Смесь нагревали до 300 ° C в атмосфере азота и впрыскивали 1,8 мл TOP. Затем смесь нагревали до 350 ° C. В эту смесь вводили раствор 8 мкмоль CdSe, диспергированного в 2 М растворе TOP: S (1,8 мл TOP: 0,120 г S). Реакцию гасили через 8 мин. После достаточного времени охлаждения к смеси добавляли 10 мл толуола. Приобретенные наностержни CdS с затравкой CdSe осаждали добавлением избытка метанола и центрифугировали при 3843 g.Наночастицы повторно диспергировали в 2 мл толуола.

4.4 Определение характеристик

4.4.1 Абсорбционная спектроскопия в УФ-видимом диапазоне

Все УФ-видимые спектры были получены из разбавленных растворов наностержней в толуоле (обычно 10 мкл исходного раствора наностержней, разбавленного до 3000 мкл) внутри кварцевых кювет объемом 1 см 3000 мкл.

Измерения, приводящие к этим результатам, должны были быть выполнены в сильно разбавленных растворах, чтобы все значения экстинкции оставались в линейной области спектрофотометров как для УФ-видимой области, так и для ААС.

4.4.2 Атомно-абсорбционная спектроскопия (AAS)

Концентрация Cd была определена с помощью измерений AAS после растворения высушенного образца частиц в царской водке и его разбавления до диапазона от 0 до 2,5 мг Cd / л в водном растворе. . Все разведения готовили в мерных колбах класса A на 50 мл. ААС измеряли в пламени ацетилен / воздух при 228 нм с помощью лампы Cd / Zn с использованием калибровочной линии, измеренной при 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 и 2,5 мг / л Cd от стандарта.

4.4.3 Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Размеры наностержней были взяты из изображений ПЭМ в светлом поле (разрешение 80 k) с автоматической оценкой программой «Image J» (типичная ошибка от ± 0,4 до ± 0,7 нм, в зависимости от качества. изображений). Здесь мы использовали эллиптическую подгонку для определения длины и ширины не менее 1000 наностержней на образец. Таким образом, эллипс лежит внутри наностержней, и измеряя самый короткий и самый длинный диаметр, можно получить ширину и длину наностержней.Этот метод был использован потому, что он свободен от предвзятости. Для дальнейшего расчета форма наностержней считалась цилиндрической.

D.D. благодарит Немецкий исследовательский фонд (исследовательский грант DFG DO 1580 / 2-1 и DO 1580 / 3-1) и фонд Volkswagen за финансирование. П.А. благодарит Avicenna-Studienwerk за финансирование. Т.К. благодарит Ганноверскую школу нанотехнологий (HSN) за финансирование. Авторы выражают благодарность Лаборатории нано- и квантовой инженерии (LNQE) Ганноверского университета имени Лейбница за поддержку.

Список литературы

1. Талапин Д.В., Ж.-С. Ли, М. В. Коваленко, Chem. Rev. 110 (2010) 389. Поиск в Google Scholar

2. К. Б. Мюррей, Д. Дж. Норрис, М. Г. Бавенди, J. Am. Chem. Soc. 115 (1993) 8706. Искать в Google Scholar

3. M. A. Hines, P. Guyot-Sionnest, J. Phys. Chem. 100 (1996) 468. Искать в Google Scholar

4. X. Peng, M. C. Schlamp, A. V. Kadavanich, A. P. Alivisatos, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 7019.Искать в Google Scholar

5. X. Peng, L. Manna, W. Yang, J. Wickham, E. Scher, A. Kadavanich, AP Alivisatos, Nature 404 (2000) 59. Искать в Google Scholar

6. Дорфс Д., Салант А., Попов И., Банин У., Смолл 4 (2008) 1319. Искать в Google Scholar

7. Талапин Д.В., Нельсон Дж., Шевченко Е.В., Алони С., Б. Sadtler, AP Alivisatos, Nano Lett. 7 (2007) 2951. Искать в Google Scholar

8. L. Carbone, C.Нобиле, М. де Джорджи, Ф. Делла Сала, Дж. Морелло, П. Помпа, М. Хитч, Э. Снок, А. Фиоре, И. Р. Франкини, М. Надасан, А. Ф. Сильвестр, Л. Чиодо, С. Кудера, R. Cingolani, R. Krahne, L. Manna, Nano Lett. 7 (2007) 2942. Поиск в Google Scholar

9. С. Итуррия, М. Д. Тесье, Б. Малер, Р. П. С. М. Лобо, Б. Дубертрет, А. Л. Эфрос, Nat. Матер. 10 (2011) 936. Искать в Google Scholar

10. М. Д. Тессье, П. Спиничелли, Д. Дюпон, Г. Патриарх, С. Итуррия, Б.Dubertret, Nano Lett. 14 (2014) 207. Поиск в Google Scholar

11. Д. В. Талапин, Дж. Х. Нельсон, Е. В. Шевченко, С. Алони, Б. Садтлер, А. П. Аливисатос, Nano Lett. 7 (2007) 2951. Поиск в Google Scholar

12. А. Фиоре, Р. Мастрия, М. Г. Лупо, Г. Ланзани, К. Джаннини, Э. Карлино, Г. Морелло, М. де Джорджи, Ю. Ли, Р. Чинголани, Л. Манна, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 2274. Искать в Google Scholar

13. Л. Манна, Д. Дж. Миллирон, А.Meisel, E.C. Scher, A.P. Alivisatos, Nat. Матер. 2 (2003) 382. Поиск в Google Scholar

14. С. Дека, К. Мишта, Д. Дорфс, А. Дженовезе, Г. Бертони, Л. Манна, Nano Lett. 10 (2010) 3770. Поиск в Google Scholar

15. Х. Ли, Р. Брешиа, Р. Кране, Г. Бертони, М. Дж. П. Алкосер, К. Д’Андреа, Ф. Скотогнелла, Ф. Тассоне, М. Занелла, М. де Джорджи, Л. Манна, ACS Nano 6 (2012) 1637. Поиск в Google Scholar

16. П. Адель, А. Вольф, Т.Kodanek, D. Dorfs, Chem. Матер. 26 (2014) 3121. Искать в Google Scholar

17. T. Kodanek, HM Banbela, S. Naskar, P. Adel, NC Bigall, D. Dorfs, Nanoscale 7 (2015) 19519. Искать в Google Scholar

18. S. Sanchez-Paradinas, D. Dorfs, S. Friebe, A. Freytag, A. Wolf, NC Bigall, Adv. Матер. 27 (2015) 6152. Искать в Google Scholar

19. Г. Менаген, Д. Мокатта, А. Салант, И. Попов, Д. Дорфс, У. Банин, Chem. Матер. 20 (2008) 6900.Искать в Google Scholar

20. C. A. Leatherdale, W.-K. Woo, F. V. Mikulec, M. G. Bawendi, J. Phys. Chem. B 106 (2002) 7619. Поиск в Google Scholar

21. W. W. Yu, L. Qu, W. Guo, X. Peng, Chem. Матер. 15 (2003) 2854. Поиск в Google Scholar

22. J. Jasieniak, L. Smith, van J. Embden, P. Mulvaney, M. Califano, J. Phys. Chem. C 113 (2009) 19468. Искать в Google Scholar

23. Э. Шавив, А. Салант, У. Банин, ChemPhysChem 10 (2009) 1028.Искать в Google Scholar

24. van J. Embden, J. Jasieniak, P. Mulvaney, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 14299. Поиск в Google Scholar

25. Дирин Д. Н., Соколикова М. С., Гасков А. М., Васильев Р. Б., Опт. Technol. 78 (2011) 693. Поиск в Google Scholar

26. H. Zhang, Y. Ye, J. Zhang, Y. Cui, B. Yang, L. Shen, J. Phys. Chem. C 116 (2012) 15660. Искать в Google Scholar

Дополнительные материалы:

Онлайн-версия этой статьи (DOI: 10.1515 / zpch-2016-0887) предлагает дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Получено: 2016-9-2

Принято: 2016-9-21

Опубликовано онлайн: 2016-10-15

Опубликовано в печати: 2017-1-1

Руководство по лаборатории менингита: идентификация и характеристика Hib

Версия для печати pdf icon [19 страниц]

H.influenzae — маленькие плеоморфные грамотрицательные бациллы или коккобациллы со случайным расположением. H. influenzae — привередливый организм, который лучше всего растет при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в сосуде для свечей) и требует гемина (X-фактор) и никотинамид-аденин-динуклеотид (NAD, также известный как фактор V) для роста. Стандартная среда, используемая для роста H. influenzae , представляет собой пластину с шоколадным агаром (CAP), которую можно приготовить из подвергнутой тепловому лизису лошадиной крови, хорошего источника как гемина, так и NAD, хотя также можно использовать овечью кровь.Рост происходит на CAP, потому что НАД высвобождается из крови во время процесса нагревания препарата шоколадного агара (процесс нагревания также инактивирует ингибиторы роста), а гемин доступен из негемолизированных, а также гемолизированных клеток крови. Альтернативно, НАД может быть включен в качестве компонента жидких добавок питательной среды H.influenzae (коммерчески доступных или полученных в лаборатории), которые вводятся в шоколадный агар. H. influenzae выглядят как большие, круглые, гладкие, выпуклые, от бесцветных до серых непрозрачных колоний на ВП (рис. 1).Инкапсулированные штаммы кажутся более мукоидными, чем неинкапсулированные штаммы, которые выглядят как более мелкие компактные серые колонии. Гемолиза или изменения цвета ВП не наблюдается. Хотя H. influenzae производит резкий запах индола, чашки не следует открывать, чтобы почувствовать запах культур. H. influenzae не может расти на БАТ без добавок. Перед процедурами тестирования на идентификацию и характеризацию изоляты всегда следует проверять на чистоту роста и при необходимости повторно штриховать одну колонию для получения чистой культуры.Для следующих процедур идентификации и определения характеристик тестирование следует проводить на 18-24-часовом росте из CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO ₂ (или в сосуде для свечей) (Рисунок 2).

Следующие тесты рекомендуются для подтверждения идентичности культур, которые морфологически выглядят как H. influenzae (рис. 3). H. influenzae можно идентифицировать с помощью оксидазного теста Ковача и определения потребности в гемине и НАД как потребности роста.Если тест на оксидазу положительный, необходимо провести тестирование на гемин и фактор роста НАД. Если тест на наличие фактора роста показывает, что изолят может быть H. influenzae , следует провести серологические тесты для определения серотипа. Эта последовательность тестирования — эффективный способ сэкономить дорогостоящие антисыворотки и время. Дополнительные методы идентификации и характеристики H. influenzae с использованием молекулярных инструментов описаны в главе 10 «Методы ПЦР» и главе 12 «Молекулярные методы».

Уровень биобезопасности 2 (BSL-2) требуется для работы с изолятами H. influenzae , поскольку этот организм представляет потенциальную опасность для персонала лаборатории и окружающей рабочей среды. См. Главу 4: Биобезопасность, чтобы следовать руководящим принципам, установленным для лаборантов, работающих на объектах BSL-2, поскольку многие тесты, описанные в этой главе, требуют вскрытия чашек с живыми культурами и часто проводятся вне шкафа биобезопасности ( BSC).

Рисунок 1. Колонии H. influenzae на CAP

Рисунок 2. Колонии H. influenzae на CAP

Оксидазный тест Ковача Тест Ковача с оксидазой определяет присутствие цитохромоксидазы. Реагент Ковача, дигидрохлорид тетраметил-п-фенилендиамина, превращается в пурпурное соединение организмами, содержащими цитохром с как часть их дыхательной цепи. Этот тест помогает распознать H. influenzae, но другие представители рода Haemophilus, а также неродственные виды бактерий также могут дать положительную реакцию.Штаммы с положительным и отрицательным контролем качества (QC) должны быть протестированы вместе с неизвестными изолятами, чтобы убедиться, что реагент оксидазы работает должным образом.
1. Приготовление 1% оксидазного реагента из порошка оксидазы Чтобы предотвратить порчу исходного порошка оксидазы, порошок следует хранить в плотно закрытом эксикаторе в прохладном темном месте. Реагент Ковача на оксидазу предназначен только для диагностического использования in vitro. Избегайте контакта с глазами и кожей, так как это может вызвать раздражение.В случае случайного контакта немедленно промойте глаза или кожу водой в течение не менее 15 минут.
  Приготовьте 1,0% -ный оксидазный реагент Ковача, растворив 0,1 г дигидрохлорида тетраметил-п-фенилендиамина в 10 мл стерильной дистиллированной воды.
  Хорошо перемешайте и дайте постоять 15 минут.
  Раствор следует делать свежим ежедневно, а неиспользованную часть следует выбросить.
  В качестве альтернативы, реагент можно разлить на аликвоты по 1 мл и хранить в замороженном виде при -20 ° C.Аликвоты следует вынуть из морозильника и разморозить перед использованием. Выбрасывайте неиспользованную часть каждый день оттаивания реагента.
2. Проведение теста на оксидазу Ковача
  Метод фильтровальной бумаги
  Выращивайте изоляты для тестирования в течение 18-24 часов на CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в банке для свечей).
  На непористую поверхность (например, чашку Петри или стеклянную пластину) смочите полоску фильтровальной бумаги несколькими каплями оксидазного реагента Ковака.
  Дайте полосе фильтровальной бумаги высохнуть на воздухе перед использованием.
  Используйте одноразовую пластиковую петлю, платиновую петлю для посева или деревянную палочку-аппликатор, чтобы выбрать часть колонии, образовавшуюся в результате ночного роста на колпачке, и протереть ею обработанную фильтровальную бумагу (рис. 4).
  Не используйте нихромовую петлю, так как это может привести к ложноположительной реакции.
  Обратите внимание на изменение цвета фильтровальной бумаги на пурпурный.
  Выполните шаги 3 и 4 с положительной и отрицательной деформацией QC, чтобы убедиться, что реагент оксидазы работает правильно.
  Рис. 4. Оксидазный тест Ковача: отрицательная и положительная реакция на фильтровальной бумаге.
  Пластинчатый метод
  Выращивайте изоляты для тестирования в течение 18-24 часов на CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в банке для свечей).
  Нанесите несколько капель оксидазного реагента Ковача непосредственно на несколько подозрительных колоний, растущих в течение 18-24 часов CAP.
  Не заливайте всю чашку, так как бактерии, подвергшиеся воздействию реагента, обычно нежизнеспособны для пересева.
  Наклоните чашку и наблюдайте за изменением цвета колоний на пурпурный.
  Выполните шаги 1 и 2 с положительной и отрицательной деформацией QC, чтобы убедиться, что реагент оксидазы работает должным образом.
3. Считывание результатов теста на оксидазу
  Положительные реакции разовьются в течение 10 секунд в виде пурпурного цвета там, где бактерии были нанесены на обработанную фильтровальную бумагу. Отсроченные реакции маловероятны с H. influenzae .
  Отрицательные реакции не приведут к изменению цвета обработанной фильтровальной бумаги.

Таблица 1. Идентификация Haemophilus spp. по их потребностям роста в гемине (X-фактор) и NAD (V-фактор) и β-гемолизу на агаре с лошадиной кровью
Организм	Требования к гемину (X-фактор)	Требования к NAD (V-фактор)	β-гемолиз на агаре с лошадиной кровью
H.influenzae	+	+	–
H. parainfluenzae ¹	–	+	–
H. haemolyticus	+	+	+
H. parahaemolyticus	–	+	+
H. aphrophilus ²	+	–	–
H.paraphrophilus ^1,2	–	+	–

Идентификация гемина и НАД как потребности роста H. influenzae является привередливым организмом и может быть идентифицирован на основе потребностей роста в гемине и НАД. H. influenzae можно отличить от большинства других видов Haemophilus по его специфической потребности как в гемине, так и в НАД для роста (таблица 1). H.haemolyticus — единственный другой вид, требующий для роста и гемина, и НАД; однако этот вид отличается от H. influenzae тем, что вызывает бета-гемолиз (чистый) в крови лошади или кролика. Для пациентов с бактериальным менингитом H. influenzae следует рассматривать в качестве предполагаемого возбудителя, в отличие от H. haemolyticus , когда для роста необходимы как геминовый, так и НАД-фактор. Чтобы различать эти два вида, необходимо проверить гемолиз на агаре с лошадиной или кроличьей кровью (см. Раздел II.B., Haemophilus ID (разрез на четырех пластинах ниже). H. haemolyticus обычно вызывает гемолиз на этих средах, а H. influenzae — нет. Недавно сообщалось, что H. haemolyticus имеют тенденцию быстро терять свои гемолитические свойства при передаче in vitro (2). Это сделало окончательную идентификацию H.influenzae и H. haemolyticus с использованием только биохимических тестов очень сложной, и другие методы, такие как молекулярное тестирование, могут быть использованы для дифференциации между двумя видами.Таблица 1. Идентификация Haemophilus spp. по их потребностям роста в гемине (X-фактор) и NAD (V-фактор) и β-гемолизу на агаре с лошадиной кровью
Таблица 1. Идентификация Haemophilus spp. по их потребностям роста в гемине (X-фактор) и NAD (V-фактор) и β-гемолизу на агаре с лошадиной кровью
Организм Требования к гемину (X-фактор) Требования к NAD (V-фактор) β-гемолиз на агаре с лошадиной кровью
H.influenzae + + –
H. parainfluenzae ¹ – + –
H. haemolyticus + + +
H. parahaemolyticus – + +
H. aphrophilus ² + – –
H.paraphrophilus ^1,2 – + –
Сноски
¹ H. parainfluenzae положителен на орнитиндекарбоксилазу, тогда как H. paraphrophilus отрицателен.
² Хотя их потребности в гемине и НАД-факторе отличаются друг от друга, H. aphrophilus и H. paraphrophilus были недавно реклассифицированы как единый вид с новым родом: Aggregatibacter aphrophilus (3).

Выполнение теста на гемин и фактор роста НАД с использованием бумажных дисков и / или полосок Требования к фактору роста можно определить с помощью бумажных дисков и / или полосок, используя принципы диффузии в агаре.
Процедура определения коэффициента роста с использованием бумажных дисков и / или полосок
Выращивайте изоляты для тестирования в течение 18-24 часов на CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в банке для свечей).
Приготовьте умеренно тяжелую суспензию клеток (сопоставимую с 1.0 стандарта МакФарланда) от выращивания в течение ночи на CAP в подходящем бульоне (триптиказо-соевый, сердечный настой или пептонная вода) и хорошо перемешайте на вортексе.
Не переносите какую-либо среду шоколадного агара из чашки в суспензию клеток, так как даже минимальное количество агара повлияет на тест и может привести к неправильной идентификации бактерий.
Засейте одну половину чашки с соевым агаром или инфузией сердца 10 мкл клеточной суспензии, используя стерильную петлю или тампон, и дайте суспензии высохнуть.
Два разных изолята можно тестировать на одной чашке, но необходимо следить за тем, чтобы культуры не перекрывались.
Поместите бумажные диски или полоски, содержащие гемин, НАД и гемин / НАД, на посевной планшет после высыхания посевного материала.
При тестировании двух бактериальных штаммов на одном планшете (рис. 5) диски должны быть размещены точно так, как показано, разделяя отдельные диски гемина и NAD дисками, содержащими оба фактора, и оставляя столько же места между дисками. насколько возможно.
Выполните шаги 1–4, используя H. influenzae и другой Haemophilus spp. Контроль качества, чтобы убедиться, что диски или полоски гемина и NAD работают должным образом.
Осторожно переверните планшет и инкубируйте 18-24 часа при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в сосуде для свечей).
Обратите внимание на рост вокруг бумажных дисков или полосок.
Рис. 5. Определение гемина (X-фактор) и NAD (V-фактор) как требований роста с использованием бумажных дисков.Верхний штамм растет только вокруг диска, содержащего гемин и НАД (черная стрелка), и предположительно идентифицируется как H. influenzae .
Считывание результатов на бумажном диске и / или полоске с гемина и NAD
H. influenzae будет расти только вокруг бумажного диска, содержащего гемин и НАД, как показано на рисунке 5 в верхней половине планшета (см. Черную стрелку).
H. haemolyticus также будет расти только вокруг бумажного диска, содержащего гемин и НАД.Чтобы различать эти два вида, необходимо проверить гемолиз на агаре с лошадиной или кроличьей кровью путем инокуляции упомянутой выше клеточной суспензии на агаре для инфузии сердца с 5% -ной кровью кролика (или основой для инфузии агара, содержащей кровь лошади). В качестве альтернативы можно использовать планшет Haemophilus ID Quad (см. Раздел II.B ниже).
Прочие Haemophilus spp. будет расти вокруг диска, содержащего гемин и NAD, а также индивидуальный гемин или диск NAD.
В качестве альтернативы можно использовать порфириновый тест (2). Это определяет потребность изолята в гемине, избегая при этом проблемы переноса гемина из первичной культуральной среды и контаминации гемином тестовых сред (3).

Выполнение теста на потребность в факторах роста гемина и НАД с использованием планшетов Haemophilus ID Quad Haemophilus ID Quad планшетов — еще один метод определения потребностей для роста изолятов Haemophilus (рис. 6).Хотя они более дорогие, чем бумажные диски или полоски, они могут тестировать на β-гемолиз (прозрачный) в крови лошади и помогать дифференцировать H. haemolyticus от H. influenzae . Пластина Quad разделена на четыре отделения. Один квадрант включает среду, содержащую только гемин (рис. 6, внизу слева). Второй квадрант включает среду, содержащую только НАД (рис. 6, вверху слева). Третий квадрант содержит среду, которая включает гемин и НАД (рис. 6, вверху справа).Четвертый квадрант содержит сердечный инфузионный агар или основу кровяного агара с 5% лошадиной крови (рис. 6, внизу справа) для обнаружения гемолиза и дифференциации H. haemolyticus от H. influenzae. Процедура определения требований к фактору роста с использованием планшетов Haemophilus ID Quad
Выращивайте изоляты для тестирования в течение 18-24 часов на CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в банке для свечей).
Приготовьте суспензию клеток (сопоставимую с 0.5 стандарт МакФарланда) от роста в течение ночи предполагаемого Haemophilus на CAP в триптиказо-соевом бульоне или дистиллированной воде и хорошо перемешайте на вортексе.
Используйте стерильную петлю для посева, чтобы нанести штрих из одной петли клеточной суспензии на один квадрант планшета Quad. Нанесите штрихи на весь квадрант, начиная с периферии пластины и заканчивая ее центром.
Используйте другую петлю для посева, чтобы нанести штриховку в каждый из других квадрантов суспензией клеток.
Нанесите удар в кровяной агар для обнаружения β-гемолиза (чистый).
Инкубируйте 18-24 часа при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в сосуде для свечей).
После инкубации исследуйте отдельные квадранты на предмет роста и квадрант с лошадиной кровью на предмет гемолиза, где на пластину была нанесена петля (рис. 6).
Считывание результатов четырехпозиционного планшета Haemophilus ID
H. influenzae будет расти только в квадранте, содержащем гемин и НАД, и квадранте, содержащем кровь лошади.Он не гемолизирует клетки крови лошади.
H. haemolyticus может потерять свои гемолитические свойства при передаче in vitro . Это сделало окончательную идентификацию H.influenzae и H. haemolyticus с использованием только биохимических тестов очень сложной, и другие методы, такие как молекулярное тестирование, могут быть использованы для дифференциации между двумя видами.
Организм, растущий либо в квадранте гемина, либо в квадранте NAD, вероятно, является другим видом Haemophilus
Если рост происходит в каждом квадранте, вероятно, изолят не является штаммом Haemophilus spp.
H. influenzae может иногда показывать небольшой рост в квадранте, содержащем только НАД.
Рисунок 6. Схема роста H. influenzae на планшете Haemophilus ID Quad
Контроль качества пластин Quad
КК
следует проводить на каждой новой партии планшетов Quad перед их использованием для неизвестных изолятов, чтобы гарантировать, что они будут поддерживать правильный рост Haemophilus spp. Три чашки из каждой полученной новой партии должны быть протестированы с использованием хорошо охарактеризованного эталонного штамма H.influenzae , H. haemolyticus и H. parahaemolyticus . Одна незасеянная чашка из каждой новой партии также должна быть протестирована, чтобы проверить загрязнение плесенью или другими организмами в лаборатории и / или инкубаторе. Контроль качества следует повторить для планшетов из партии, если они подвергались воздействию температур выше 4 ° C или если есть основания подозревать, что планшеты были загрязнены с момента проведения первоначального контроля качества.
Порядок контроля качества четырех пластин
Осмотрите планшеты Quad на наличие признаков микробного загрязнения, обесцвечивания, высыхания, порчи или других физических дефектов, которые могут помешать использованию.Обратите внимание на твердость агара во время процедуры посева.
Выращивайте контрольные штаммы для тестирования в течение 18-24 часов в CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в сосуде для свечей).
Засейте планшеты Quad, используя клеточные суспензии из эталонных штаммов, как описано в процедуре Quad планшетов выше.
Инкубируйте чашки в течение 18-24 часов при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в сосуде для свечей).
В качестве отрицательного контроля на контаминацию инкубируйте неинокулированный планшет из каждой новой партии в течение 18-24 часов при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в сосуде для свечей).
Проверьте засеянные и незасеянные чашки через 18–24 часа на предмет надлежащего роста Haemophilus spp.
Считывание результатов контроля качества
H. influenzae будет расти только в квадранте, содержащем гемин и НАД, и квадранте, содержащем кровь лошади. Он не гемолизирует клетки крови лошади.
H. haemolyticus будет расти только в квадранте, содержащем гемин и НАД, и квадранте, содержащем кровь лошади.Он гемолизирует клетки крови лошади.
H. parahaemolyticus будет расти во всех квадрантах, кроме того, который содержит только гемин. Он гемолизирует клетки крови лошади.
H. parahaemolyticus будет расти во всех квадрантах, кроме квадранта, содержащего только гемин. Он гемолизирует клетки крови лошади.
Неудачный результат: отсутствие роста или плохой рост эталонного штамма на подходящей среде и / или рост организмов на неинокулированной среде.

Идентификация H.influenzae серотип Haemophilus influenzae может быть инкапсулирован одним из шести типов антигенно различных капсул, которые могут быть серотипированы с использованием антисыворотки к каждой капсуле (серотипы a-f). H. influenzae также может быть неинкапсулированным, и такие штаммы, которые не могут быть серотипированы, называются H. influenzae нетипируемыми (NT). Индивидуальные серотип-специфические антисыворотки для этих основных серотипов коммерчески доступны. Поливалентная антисыворотка, распознающая все 6 серотипов, также коммерчески доступна.Не всегда практично проверять все серотипы, против которых имеются антисыворотки, в лаборатории. Алгоритмы тестирования могут быть созданы в лабораториях, заранее осведомленных о том, была ли внедрена программа вакцинации против H. influenzae серотипа b (Hib) в данном конкретном географическом регионе. В алгоритм тестирования любой лаборатории могут быть внесены изменения на основе информации о статусе вакцинации против Hib в регионе. Важно, чтобы справочные лаборатории имели возможность выделять, идентифицировать и характеризовать серотип изолятов H.грипп . Эти ценные данные предоставляют лабораториям и органам здравоохранения инструменты для выявления вспышек, контролируемых кампаниями вакцинации, и распознавания серотипов, вызывающих спорадические заболевания.
Алгоритм теста SAST для районов, где не действует программа вакцинации против Hib
Если программа вакцинации против Hib не была реализована в стране или регионе, из которого был получен изолят, вероятно, что изолят H. influenzae относится к серотипу b, и этот изолят необходимо сначала проверить на реактивность к антисыворотке серотипа b и антисыворотке. отрицательный солевой контроль.Если изолят положительно реагирует с антисывороткой серотипа b без агглютинации в физиологическом растворе, изолят идентифицируется как Hib. Однако, если изолят не реагирует с антисывороткой серотипа b и если доступна поливалентная антисыворотка, его следует протестировать с поливалентной антисывороткой. В случае положительного результата изолят затем следует протестировать с оставшейся моновалентной антисывороткой (a, c, d, e и f) для определения серотипа. Если отрицательный результат по всем моновалентным антисывороткам и положительный результат по гемину и требованиям роста НАД, то изолят считается NT.
Алгоритм теста SAST для районов с установленной программой вакцинации против Hib
Если изолят из страны или региона с установленной программой вакцинации против Hib, которая имеет высокий охват вакцинацией против Hib, изолят, скорее всего, будет NT или серотипом, отличным от b. В этом случае изолят сначала следует протестировать с поливалентной антисывороткой, если таковая имеется, и отрицательным контролем с физиологическим раствором. Если поливалентная антисыворотка положительна без агглютинации в физиологическом растворе, изолят затем следует протестировать с оставшейся моновалентной антисывороткой (a, b, c, d, e и f) для определения серотипа.Если изолят отрицательный на поливалентную антисыворотку и / или моновалентную антисыворотку и требует гемина и НАД для роста, то изолят считается NT.
Тест серотипирования агглютинации на слайдах (SAST) для серотипирования изолятов H. influenzae Для обеспечения безопасной рабочей среды следует использовать убитые формалином суспензии H. influenzae , а не физиологические суспензии живых организмов. Для уничтожения бактерий достаточно 5% раствора физиологического раствора формалином.Однако формалин является канцерогеном, поэтому при хранении и обращении с ним необходимо соблюдать особую осторожность. В качестве альтернативы, если формалин не используется, работу следует выполнять под защитным кожухом. Антисыворотку следует хранить в холодильнике при температуре 4 ° C и подогревать до комнатной температуры (25 ° C) перед использованием. Его необходимо снова положить в холодильник, как только тестирование будет завершено, чтобы предотвратить потерю связывающей активности антитела.
Выполнение теста SAST
Выращивайте изоляты для тестирования в течение 18-24 часов на CAP при 35-37 ° C с ~ 5% CO. ₂ (или в банке для свечей).
Очистите предметное стекло спиртом (необязательно, если предметные стекла предварительно очищены).
Разделите слайд на равные части (например, двенадцать секций размером 11 х 22 мм на стандартном слайде 50 х 75 мм) с помощью непроницаемой для жидкости ручки или воскового карандаша.
Для каждого изолята потребуется столько срезов на слайде, сколько будет тестироваться антисыворотка (поливалентная и / или индивидуальная серотип-специфическая), а также отрицательный контроль с физиологическим раствором.
В нижнюю часть каждого из участков предметного стекла, описанного в шаге (2), добавьте 10 мкл 5% формалинового физиологического раствора с помощью микропипеточной машины.
В инструкциях указано использование микропипетки со стерилизованными фильтруемыми наконечниками для измерения 10 мкл 5% формалинового физиологического раствора для суспендирования бактерий. Микропипеточный дозатор будет передавать точные и равные измерения для правильной реакции SAST.
Если микропипетка и наконечники недоступны, можно использовать стерильные одноразовые петли для посева на 10 мкл для переноса 10 мкл 5% формалинового физиологического раствора, но часто они не доставляют точных количеств (от 5 до 10 мкл).
Используйте стерильную одноразовую петлю для посева на 10 мкл, чтобы собрать несколько колоний с поверхности ночной культуры, инкубированной на CAP.
Взвесьте бактерии в 5% -ном формалинизированном физиологическом растворе в нижней части каждого из участков предметного стекла. Суспензия должна быть умеренно непрозрачной (см. Контрольный раствор солевого раствора на рисунке 7). Не позволяйте клеточной суспензии высохнуть перед добавлением антисыворотки.
Если бактерии трудно суспендировать непосредственно на предметном стекле, приготовьте умеренно молочную суспензию (сопоставимую со стандартом McFarland 6.0) тестовой культуры в небольшом флаконе с 250 мкл 5% формалинизированного физиологического раствора и кратковременно встряхните суспензию, чтобы перемешать и перемешать. разбейте любые гранулы.Добавьте 10 мкл этой суспензии в нижнюю часть слайда.
В верхнюю часть каждого среза предметного стекла, описанного на этапе (2), добавьте 10 мкл поливалентной и / или серотип-специфической антисыворотки для тестирования, а также неформалинизированный физиологический раствор или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) для отрицательный контроль с микропипеткой.
НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ пипетку, поставляемую с антисывороткой, потому что она обычно доставляет большее количество, чем необходимо, и легко может быть заражена.
Если микропипетка и наконечники недоступны, можно использовать стерильные одноразовые петли для посева на 10 мкл для переноса 10 мкл антисыворотки, но часто они не доставляют точных количеств (от 5 до 10 мкл).
Утилизируйте наконечник или петлю, использованные для переноса антисыворотки на предметное стекло в контейнер для отходов после каждого использования, чтобы избежать загрязнения антисыворотки. Если источник антисыворотки загрязнен, необходимо использовать новый флакон.
Осторожно наклоните предметное стекло, чтобы смешать клеточные суспензии с антисывороткой в каждой секции.Продолжайте осторожно покачивать предметное стекло в течение 1-2 минут, чтобы нижняя и верхняя части полностью смешались. Не используйте круговые движения во время покачивания, так как это может привести к слиянию участков с антисыворотками, специфичными для различных серогрупп, и заражению друг друга.
Через 2 минуты изучите реакции SAST при ярком свете и на черном фоне. Используйте рейтинговую систему на рисунке 7, чтобы определить интенсивность реакции агглютинации в каждом разделе слайда.Игнорируйте любую агглютинацию, которая происходит после 2-х минутного периода времени.
Запишите результаты SAST в лабораторный журнал.
Чтение результатов SAST
Оценка интенсивности реакции агглютинации
Агглютинация происходит, когда антисыворотка связывается с бактериальными клетками, заставляя клетки агглютинировать или слипаться вместе, что делает суспензию клеток более прозрачной. Интенсивность реакции агглютинации может варьироваться в зависимости от плотности клеточной суспензии или используемой антисыворотки.Описание значений интенсивности, показанных на Рисунке 7, приведено ниже.
4+ Все клетки агглютинируются, и клеточная суспензия кажется прозрачной
3+ 75% клеток агглютинируются, и клеточная суспензия остается слегка мутной
2+ 50% клеток агглютинируются, и клеточная суспензия остается слегка мутной
1+ 25 % клеток агглютинируют, и суспензия клеток остается слегка мутной
+/- Менее 25% клеток агглютинируют, и образуется мелкозернистое вещество
0 Агглютинация отсутствует; подвеска остается мутной и гладкой
Рисунок 7.Рейтинг интенсивности реакции агглютинации
Определение серотипа
Положительный результат обозначается цифрой 3+ или 4+ (сильная агглютинация) в течение 1-2 минут.
Отрицательный результат обозначается цифрами 0 (физиологический раствор), +/-, 1+ или 2+ (слабая агглютинация).
Серотип определяется, когда положительный результат наблюдается с поливалентной антисывороткой и / или только с одной из серотип-специфичных антисывороток, а не с физиологическим раствором.
Если серотип не определен, изолят считается NT.Все следующие комбинации результатов отображаются как NT:
Агглютинация в физиологическом растворе, независимо от сильных реакций с поливалентной или другой серотип-специфической антисывороткой, характеризует культуру как аутоагглютинирующую.
Агглютинация поливалентной и / или более чем одной серотип-специфической антисывороткой в отсутствие агглютинации в физиологическом растворе характеризует культуру как полиагглютинирующую или перекрестно-реактивную.
Отсутствие агглютинации с поливалентной или какой-либо серотип-специфической антисывороткой или физиологическим раствором характеризует штамм как нереактивный.
Хотя это и бывает редко, изолят, положительный в отношении поливалентной антисыворотки, но отрицательный в отношении серотип-специфической антисыворотки, считается NT.
Устранение неполадок процедуры SAST Изоляты H.influenzae подвержены изменчивости (инкапсулированные или неинкапсулированные, маленькие и большие колонии, медленные агглютинаторы против быстрых агглютинаторов против легких агглютинаторов) и могут быть нечеткими или трудными для интерпретации . Некоторые процедуры устранения неполадок перечислены ниже:
Повторите тест непосредственно на предметном стекле, используя рост из другого участка той же пластины.
Сделайте суспензию клеток в маленькой пробирке и перемешайте, если результат SAST непосредственно на слайде неясен, и повторите тест.
Добавьте 20 мкл антисыворотки непосредственно на предметное стекло, а затем добавьте петлю организма, не разбавляя образец 5% формалинизированным физиологическим раствором.
Пересадите и повторно протестируйте свежий рост на следующий день.
Если исходная чашка содержит колонии разного размера, сделайте субкультуру для каждого типа колонии и протестируйте обе культуры на следующий день.Более крупные колонии обычно указывают на лучшее производство капсул и, следовательно, на лучшую реактивность. Однако небольшие колонии иногда дают лучший результат.
Если расхождения не устраняются немедленно, любые последующие повторы SAST следует использовать вместе с контрольными штаммами.
Контроль качества антисыворотки для тестирования SAST Набор эталонных штаммов для H. influenzae серотипов a, b, c, d, e и f (по одному на серотип) и нетипируемого H.influenzae следует использовать для контроля качества антисыворотки перед тестированием любых неизвестных изолятов. Контроль качества антисыворотки должен быть:
Выполняется для каждой новой партии антисыворотки, полученной в лаборатории.
Выполняется один раз в два года после первоначального тестирования QC.
Повторяется, если флакон подвергался воздействию температур выше 4 ° C или есть основания подозревать, что флакон был загрязнен с момента проведения первоначального контроля качества.
Следуйте процедуре тестирования SAST для контроля качества каждой партии антисыворотки с использованием всех референсных штаммов, имеющихся в лаборатории.Запишите результаты, представленные в образце листа контроля качества на Рисунке 8.
Считывание результатов проверки качества
Сдал тест:
Антисыворотка должна давать агглютинацию 3+ или 4+ с гомологичными антигенами в течение 1-2 минут.
Антисыворотка не должна вступать в реакцию с гетерологичными серотипами H. influenzae , эталонным штаммом NT или физиологическим раствором.
Неудачный тест:
Коммерческие идентификационные наборы Для идентификации Haemophilus spp доступны несколько коммерческих систем идентификации, в которых используются биохимические или ферментативные субстраты.Эти системы могут иногда требовать дополнительных тестов, и необходимо учитывать дополнительные характеристики, такие как микроскопическая морфология и морфология колоний. Обычно каждая система является автономной, но может потребоваться добавление одного или нескольких реагентов для завершения определенных реакций. При использовании этих наборов необходимо точно следовать инструкциям производителя. Некоторые из коммерческих наборов для идентификации также включают биотипирование H. influenzae . Для получения подробных инструкций и использования соответствующих контрольных штаммов обратитесь к Справочнику по клиническим микробиологическим процедурам (1).

Список литературы

Справочник по процедурам клинической микробиологии, 3-е издание. 2010. ASM. Вашингтон, округ Колумбия, 2540 страниц.
Мюррей П. Р., Э. Дж. Барон, Дж. Х. Йоргенсен, М. Л. Лэндри и М. А. Пфаллер (ред.). Руководство по клинической микробиологии , 9-е изд., Т. 2007. ASM Press, Вашингтон, округ Колумбия,
Норсков-Лауритсен Н. и Килиан М. . Реклассификация Actinobacillus actinomycetemcomitans, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus paraphrophilus и Haemophilus segnis как Aggregatibacter actinomycetemcomitans gen.нов., гребешок. nov., Aggregatibacter aphrophilus греб. ноя и Aggregatibacter segnis comb. nov., и исправили описание Aggregatibacter aphrophilus , включив в него изоляты, зависимые от фактора NAD и независимые от фактора NAD. 2006. Международный журнал систематической и эволюционной микробиологии . 56: 2135-2146 .

Начало страницы

Вернуться к руководству по лабораторным методам

грамм красителя | Лабораторные тесты онлайн

Источники, использованные в текущем обзоре

Окраска по Граму.Медицинские лаборатории Мэйо. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/8078. По состоянию на январь 2017 г.

Окраска по Граму. Медицинский центр Университета Рочестера, Энциклопедия здоровья. Доступно в Интернете по адресу https://www.urmc.rochester.edu/encyclopedia/content.aspx?ContentTypeID=167&ContentID=gram_stain/. По состоянию на январь 2017 г.

Patolia S., et al. (Обновлено 11 декабря 2015 г.) Пятно по Граму. Medscape. Доступно на сайте http: // emedicine.medscape.com/article/2093371-overview. По состоянию на январь 2017 г.

Hazen, K.C. (Изменено в октябре 2016 г.). Микроскопия. Руководство Merck, профессиональная версия. Доступно в Интернете по адресу http://www.merckmanuals.com/professional/infectious-diseases/laboratory-diagnosis-of-infectious-disease/microscopy. По состоянию на январь 2017 г.

Источники, использованные в предыдущих обзорах

Атлас лабораторной микроскопии кабинета врача , 3-е изд., 2007 г. Хендерсон и Мюррей. Американская академия семейных врачей. Проверка квалификации.

Vorvick, L. (Обновлено 9 августа 2009 г.).Эндоцервикальное окрашивание по Граму. Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003753.htm. По состоянию на февраль 2010 г.

Yuki Uehara, Y. et. al. (18 сентября 2009 г.). Влияние отчета о результатах окрашивания по Граму из бутылок для культивирования крови на выбор противомикробных агентов. Medscape Today из Американский журнал клинической патологии [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/708594.По состоянию на февраль 2010 г.

Генри. Клиническая диагностика и лечение лабораторными методами . 21-е изд. Макферсон Р., Пинкус М., ред. Филадельфия, Пенсильвания: Saunders Elsevier: 2007, Pp 1016-1017.

(© 2012) Кавано Д., Кин М., Американское общество микробиологии. Пятно по Граму: анимированный подход. Доступно в Интернете по адресу http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/3018-the-gram-stain-an-animated-approach. По состоянию на сентябрь 2013 г.

(обновлено 22 июля 2103 г.) Смит А., Хасси М., Американское общество микробиологии.Протоколы окрашивания по Граму. Доступно в Интернете по адресу http://www.microbelibrary.org/component/resource/gram-stain/2886-gram-stain-protocols. По состоянию на сентябрь 2013 г.

(обновлено 21 февраля 2013 г.) Patolia S, et al. Окраска по Граму. Справочная статья Medscape. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/2093371-overview. По состоянию на сентябрь 2013 г.

Uehara Y, et al. Влияние отчета о результатах окрашивания по Граму из бутылок для культивирования крови на выбор противомикробных агентов. Am J Clin Pathol 2009 132: 18-25.Доступно в Интернете по адресу http://ajcp.ascpjournals.org/content/132/1/18.full?sid=b349478c-9108-4e9c-b957-5547886cb78c. По состоянию на сентябрь 2013 г.

Munson E, et al. Механизмы оценки квалификации специалистов по интерпретации пятен по Граму в спутниковых лабораториях. J. Clin. Microbiol. ноябрь 2007 г. 45 нет. 11 3754-3758. Доступно в Интернете по адресу http://jcm.asm.org/content/45/11/3754.long. По состоянию на сентябрь 2013 г.

Анализ in vivo точечных мутаций, связанных с заболеванием, выявил глубокие различия в сплайсинге мРНК периферина-2 в палочковидных и конусных фоторецепторах

Abstract

Точечные мутации в периферине-2 (PRPh3) связаны с тяжелыми дегенеративными нарушениями сетчатки, затрагивающими фоторецепторы палочек и / или колбочек. Были идентифицированы различные мутации, вызывающие заболевание, но точный вклад данной мутации в клинический фенотип остается неясным.Обычно предполагается, что экзонные точечные мутации изменяют отдельные аминокислоты, тем самым влияя на конкретные характеристики белка; однако они также могут влиять на сплайсинг мРНК. Чтобы изучить эффекты отдельных точечных мутаций PRPh3 на сплайсинг мРНК и экспрессию белка in vivo , мы сконструировали минигены PRPh3, содержащие три кодирующих экзона и соответствующие интронные области человеческого PRPh3. Минигены, несущие мутации PRPh3 или PRPh3 дикого типа в экзоне 2, связанные с расстройствами палочек или колбочек, экспрессировали в мышиных фоторецепторах с использованием векторов рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).Мы обнаруживаем три изоформы сплайсинга PRPh3 в палочках и колбочках: правильно сплайсированные, с сохранением интрона 1 и без сплайсинга. Кроме того, мы показываем, что только правильно сплайсированная изоформа приводит к детектируемой экспрессии белка. Неожиданно, по сравнению с палочками, дифференциальный сплайсинг приводит к более низкой экспрессии правильно сплайсированного и более высокому уровню экспрессии несплайсированного PRPh3 в колбочках. Эти результаты были подтверждены в экспериментах кОТ-ПЦР на мышиных палочках и колбочках, отсортированных по FAC. Поразительно, что три из пяти мутаций PRPh3 колбочки, вызывающие болезнь, значительно усиливали правильное сплайсинг PRPh3, что коррелировало с сильной повышающей регуляцией экспрессии мутантного белка PRPh3 в колбочках.Напротив, четыре из шести мутантов PRPh3, ассоциированных с нарушениями палочек, вызывают снижение экспрессии белка PRPh3 посредством различных механизмов. Эти механизмы включают аберрантный сплайсинг мРНК, неправильную локализацию белка и деградацию белка. Наши данные предполагают, что повышение уровня PRPh3 в сочетании с дефектами функции PRPh3, вызванными мутацией, может быть важным механизмом, ведущим к дегенерации колбочек. Напротив, патология палочко-специфических мутаций PRPh3 скорее характеризуется подавлением PRPh3 и нарушением локализации белка.

Сведения об авторе

Фоторецепторы — это светочувствительные клетки сетчатки, состоящие из стержней, опосредующих тусклый свет и ночное зрение, и конусов, опосредующих дневное и цветовое зрение. PRPh3 имеет решающее значение для структурной и функциональной целостности фоторецепторов. Некоторые точечные мутации в PRPh3 приводят к дегенерации палочек, тогда как другие влияют только на колбочки. Мы исследовали потенциальные эффекты 11 связанных с заболеванием мутаций PRPh3 на сплайсинг мРНК и экспрессию белка in vivo .Для этого мы экспрессировали шесть мутантов PRPh3, связанных с дегенерацией палочек в палочках мышей, и пять дополнительных мутантов, связанных с болезнями колбочек в колбочках мышей. Мы демонстрируем, что различная эффективность сплайсинга PRPh3 приводит к его высокой экспрессии в палочках и к низкой экспрессии в колбочках. Кроме того, мы показываем, что большинство мутантов PRPh3, ассоциированных с нарушениями колбочек, приводит к усилению экспрессии PRPh3 в колбочках за счет увеличения эффективности сплайсинга мРНК. Напротив, большинство мутантов PRPh3, ассоциированных с болезнями палочек, приводит к подавлению экспрессии PRPh3 в палочек посредством различных механизмов, включая аберрантный сплайсинг мРНК.Эти результаты предоставляют новое понимание патобиологии сплайсинга мРНК в фоторецепторах и могут способствовать объяснению дифференциальной пенетрантности мутантов PRPh3 в палочках и колбочках.

Образец цитирования: Becirovic E, Böhm S, Nguyen ONP, Riedmayr LM, Koch MA, Schulze E, et al. (2016) In vivo Анализ точечных мутаций, связанных с заболеванием, обнаруживает глубокие различия в сплайсинге мРНК периферина-2 в палочковидных и конусных фоторецепторах. PLoS Genet 12 (1): e1005811.https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811

Редактор: Ананд Сваруп, Национальный институт глаз, США

Поступила: 27 августа 2015 г .; Дата принятия: 22 декабря 2015 г .; Опубликовано: 21 января 2016 г.

Авторские права: © 2016 Becirovic et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft, номер гранта BE 4830 / 1-1. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Сетчатка преобразует свет в электрические сигналы через два узкоспециализированных типа нейронов, палочковидные и колбочковые фоторецепторы.Оба типа фоторецепторов экспрессируют в своих светочувствительных внешних сегментах (внешние сегменты палочек, ROS и внешние сегменты колбочек, COS, соответственно) специфический член семейства белков тетраспанина, периферин-2 (PRPh3). PRPh3 является гликозилированным белком, несущим четыре трансмембранные спирали, и было обнаружено, что он имеет решающее значение для развития и структурной целостности внешних сегментов фоторецепторов [1, 2]. Мутации в гене PRPh3 человека связаны с заболеваниями сетчатки, влияющими на структуру или функцию палочек или колбочек.Некоторые из этих мутаций приводят к аутосомно-доминантному пигментному ретиниту (adRP), дегенеративному заболеванию, которое в первую очередь затрагивает фоторецепторы палочки, тогда как другие приводят к различным типам аутосомно-доминантных расстройств, характеризующихся дефектами колбочек [3]. Молекулярные пути, лежащие в основе специфичности колбочек и для отдельных мутаций PRPh3, в настоящее время неизвестны. Подавляющее большинство мутаций PRPh3 являются точечными мутациями, и многие из них расположены в экзоне 2, который кодирует дистальную половину петлевого домена, соединяющего третий и четвертый трансмембранные сегменты (петля D2), и проксимальную половину четвертого трансмембранного домена. .Предыдущие исследования продемонстрировали, что связанные с заболеванием экзонные точечные мутации могут влиять на регуляторные элементы сплайсинга мРНК с помощью различных механизмов [4]. Эти механизмы включают устранение существующих или создание новых донорных или акцепторных сайтов [4, 5]. Альтернативно, экзонные точечные мутации могут также влиять на связывающие мотивы так называемых энхансеров сплайсинга экзонов (ESE) или сайленсеров сплайсинга экзонов (ESS) [6, 7]. Эти связывающие мотивы обычно состоят из 4-18 нуклеотидов и регулируют конститутивный и альтернативный сплайсинг [8, 9].Точечные мутации, которые изменяют существующие или генерируют новые сайты связывания для ESE или ESS, могут привести либо к пропуску соответствующего экзона, либо к удержанию фланкирующих интронов [4, 8, 10]. Более того, дифференциальный сплайсинг происходит в высокой степени клеточно-специфическим образом [11], что подчеркивает необходимость анализа дефектов сплайсинга в интересующем типе клеток (например, палочковидный или колбочковый фоторецептор). Большое количество связанных с заболеванием экзонных точечных мутаций было идентифицировано в генах, которые, как известно, имеют решающее значение для функциональной и структурной идентичности фоторецепторов (https: // sph.uth.edu/retnet/disease.htm). Однако потенциальные эффекты этих точечных мутаций на сплайсинг мРНК в их естественной среде до сих пор не исследовались ни для одного из этих генов. Более того, исследования влияния экзонных точечных мутаций на регуляторные элементы сплайсинга были выполнены на минигенах, которые не покрывают полноразмерную кодирующую последовательность и, следовательно, не позволяют сопутствующий анализ того, как мутации влияют на экспрессию белков [12]. Однако параллельный анализ экспрессии белков важен для анализа механизмов, ведущих к болезненным состояниям.Чтобы изучить влияние точечных мутаций экзонного PRPh3 на сплайсинг и экспрессию белка в фоторецепторах, мы сконструировали векторы rAAV, которые экспрессируют минигены PRPh3, содержащие нативные канонические сайты сплайсинга и все три кодирующих экзона PRPh3 под контролем либо палочки, либо конус-специфичного промотора. Используя этот подход, мы выяснили, что дифференцированный сплайсинг мРНК, специфичный для типов клеток и мутаций, является новым механизмом, регулирующим экспрессию белка PRPh3 в здоровых и больных фоторецепторах палочек и колбочек.

Результаты

Минигены rAAV-PRPh3 обеспечивают эффективную экспрессию PRPh3 в палочках и колбочках

Весь ген PRPh3 человека, включая 5 ’и 3’ нетранслируемые области, экзоны и интроны, составляет приблизительно 26 т.п.н. (рис. 1A, верхняя панель). Следовательно, учитывая ограниченную емкость векторов rAAV [13], сплайсинг не может быть проанализирован на нативном транскрипте PRPh3. Пытаясь изучить сплайсинг PRPh3 в фоторецепторах палочек и колбочек, мы удалили большинство интронных последовательностей за исключением 180-200 п.н., фланкирующих экзоны и 5 ’конца гена PRPh3 (рис. 1A, нижняя панель).Эту конструкцию сливали с цитриновой меткой, чтобы можно было отслеживать экспрессию PRPh3, полученную из минигена. Полученную конструкцию вставляли в вектор rAAV, содержащий промотор либо родопсина человека (т.е. специфичный для стержня), либо промотор коротковолнового опсина мыши (т.е. специфичный для колбочки), с получением минигенных векторов rP-mg и cP-mg, соответственно (рис. 1B). Правильный сплайсинг этих минигенов приводит к меченному цитрином на N-конце PRPh3 с молекулярной массой прибл. 66,5 кДа (рис. 1С). rP-mg и cP-mg были упакованы в виде вирусных частиц AAV2 / 8 Y733F [13, 14] и доставлены в субретинальное пространство двухнедельных (P14) мышей дикого типа.Последующий анализ экспрессии PRPh3, полученной из минигена, контролировали через три недели после инъекции по флуоресценции цитрина на срезах сетчатки инъецированных животных. И в ROS, и в COS цитрин экспрессировался исключительно во внешних сегментах (рис. 1D и 1E).

Рис. 1. Дизайн и in vivo экспрессия минигенов PRPh3.

(A) Экзон-интронная структура природного PRPh3 человека (верхняя панель) и производного минигена PRPh3, используемых в этом исследовании (нижняя панель). В минигене интрон 1 и интрон 2 были в значительной степени удалены, за исключением последовательностей, фланкирующих экзоны 1-3, как указано.(B) Минигенные конструкции PRPh3, содержащие различные промоторы, используемые для анализа в стержнях (rP-мг; вверху) и колбочках (cP-мг; внизу). hRHO, промотор родопсина человека; mSWS, промотор S-опсина мыши. Чтобы обеспечить визуализацию PRPh3, полученного из минигена, без антител, цитриновая метка была слита с экзоном 1 (N-конец) PRPh3. (C) Топология правильно сплайсированного PRPh3, меченного цитрином. N- и C-концы обращены к внутриклеточной стороне фоторецепторов. Напротив, петля D2 расположена на интрадискальной (палочки) или внеклеточной (колбочки) стороне (см.S1 Рис). (D и E) Иммуногистология сетчатки мышей, инъецированных на P14 с rP-mg (D) и cP-mg (E), соответственно. Сетчатку собирали через три недели после инъекции. Масштабная линейка соответствует 20 мкм. Антитела CNGB1a (B1a) и M-опсин (M-ops) использовали для мечения внешних сегментов палочек и колбочек, соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.g001

In silico Анализ сплайсинга мРНК экзона 2 точечных мутаций PRPh3
Экзон 2 PRPh3 представляет собой горячую точку мутации и кодирует дистальную часть домена петли D2 и проксимальную половину трансмембранного домена 4 (S1 на фиг.).Первоначально мы выполнили in silico, прогнозирование потенциальных эффектов 30 точечных мутаций PRPh3, специфичных для экзона 2, на аберрантный сплайсинг мРНК с использованием программного обеспечения для прогнозирования сплайсинга ASSEDA и NNSplice. Для предсказания in silico мы использовали последовательности 40 п.н., фланкирующие соответствующую мутацию от каждого сайта. Этот анализ предоставил различные предсказанные эффекты на сплайсинг мРНК для многих мутантов, включая потенциальное создание новых донорных или акцепторных сайтов и отмену или создание сайтов связывания для ESE или ESS (таблица S1).Чтобы экспериментально проверить потенциальные различия мутантов PRPh3 при сплайсинге мРНК, мы случайным образом выбрали одиннадцать точечных мутантов, которые, как было предсказано, повлияют на сплайсинг на основе анализа in silico . Шесть из этих мутантов связаны с аутосомно-доминантным пигментным ретинитом (adRP), наиболее распространенным типом наследственных аутосомно-доминантных дегенеративных заболеваний сетчатки, тогда как пять обнаруживаются у пациентов, страдающих различными типами заболеваний колбочек (Таблица 1). Ни один из этих мутантов ранее не анализировался на предмет их потенциального воздействия на сплайсинг мРНК.
Сравнительный сплайс-анализ минигенов PRPh3 дикого типа и мутантных в палочках и колбочках
Мы проанализировали сплайсинг мРНК точечных мутантов PRPh3 с помощью ОТ-ПЦР, выполненной с миниген-специфичными праймерами, и сравнили паттерн продуктов сплайсинга после палочковой или конус-специфической экспрессии, соответственно (рис. 2А). С этой целью мышам дикого типа (WT) инъецировали на P14 WT или соответствующие мутантные конструкции PRPh3. Через три недели после инъекции РНК выделяли и объединяли из четырех сетчаток четырех инъецированных животных.Идентичность транскриптов подтверждали прямым секвенированием очищенных ампликонов (S2 на фиг.). Были получены три различных продукта сплайсинга для минигенов WT и мутантного PRPh3 в палочках и колбочках. Эти три продукта сплайсинга соответствовали i) несплайсированному варианту, содержащему оба интрона, ii) варианту сплайсинга с сохраненным интроном 1 и iii) правильно сплайсированному PRPh3. Связанная с adRP мутация G249S привела к появлению четвертого варианта сплайсинга, который содержал делецию в рамке считывания 90 п.н. на 3′-конце экзона 2, вызванную использованием нового донорского сайта (DS) (рис. 2A и 2B). ).Однако наиболее интригующим открытием было то, что, за исключением палочек, несплайсированный транскрипт PRPh3 был наиболее заметной изоформой сплайсинга в колбочках, а правильно сплайсированный транскрипт PRPh3 присутствовал в меньших количествах в этом типе клеток (Рис. 2A).
Рис. 2. Сплайс-анализ PRPh3 WT и мутантных минигенов в палочках и колбочках.
(A) Репрезентативная ОТ-ПЦР на основе кДНК, полученной из общей РНК через три недели после инъекции из сетчатки, в которую вводили дикого типа и мутантный rP-mg (слева) или cP-mg (справа) на P14.Ctrl, контроль, содержащий кДНК из нетрансдуцированной сетчатки. Отдельные полосы соответствующих продуктов для сварки пронумерованы (1–4) и выделены стрелками. (B) Схематическое изображение обнаруженных вариантов сплайсинга с использованием праймеров, связывающихся с 3’-концом цитрина и с 5’-концом экзона 3, как указано стрелками. Номера конструкций соответствуют полосам, отмеченным в (A). (C-E) Полуколичественный анализ относительной интенсивности несплайсированных (C), удерживаемых интроном 1 (D) и правильно сплайсированных (E) транскриптов PRPh3.Для каждого минигена PRPh3 средний процент интенсивностей этих трех вариантов по отношению к общей интенсивности (выраженной как сумма отдельных интенсивностей) был рассчитан из пяти анализов ОТ-ПЦР, проведенных с переменным числом циклов (25–27 для стержней). и 30–32 для шишек соответственно). Тест на значимость мутантов палочки или колбочки для соответствующего дикого типа (однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Данетта) проводили для rP-mg и cP-mg, соответственно. Все данные были показаны как средние значения, а полосы ошибок представляют стандартную ошибку среднего (SEM).*, р <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001. DS, сайт донора сплайсинга.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.g002
Полуколичественный анализ изоформ сплайсинга PRPh3
Для количественной оценки трех вариантов сплайсинга PRPh3 (без сплайсинга, удержания интрона 1 и правильно сплайсированного) мы вводили мышам в точке P14 rAAV, экспрессирующие минигены WT или мутантного PRPh3, и выделяли РНК через три недели после инъекции. Для экспериментов с ОТ-ПЦР мы использовали РНК, выделенную из набора из четырех инъецированных сетчаток, объединенных для каждой WT или мутантной конструкции.Чтобы определить линейный диапазон амплификации, мы выполнили количественную ОТ-ПЦР (qRT-PCR) у мышей, которым инъецировали WT PRPh3 в палочках и колбочках с использованием праймеров, как показано на фиг. 2B. Линейный диапазон усиления был между 20–28 циклами для стержней и между 26–33 циклами для колбочек, соответственно (S3 Рис.). Впоследствии было проведено пять повторностей технической RT-PCR с использованием переменного числа циклов, попадающих в соответствующий диапазон линейной амплификации в палочках и колбочках. Мы рассчитали средний процент несплайсированных, удерживающих интрон 1 и правильно сплайсированных транскриптов по отношению к сумме интенсивностей полос для всех минигенов PRPh3.Анализ данных выявил глубокие различия в относительном процентном содержании изоформ одиночного сращивания в стержнях и колбочках, соответственно. Эти различия наблюдались при сравнении сплайсинга минигенов WT PRPh3 в палочках и колбочках, а также при сопоставлении эффектов отдельных мутантов с соответствующими WT в данном типе клеток. Для WT PRPh3 в стержнях основной изоформой сплайсинга был правильно сплайсированный транскрипт (приблизительно 70%), тогда как сплайсинг WT PRPh3 в колбочках давал лишь небольшие количества этой изоформы PRPh3 (прибл.2%, Рис. 2E и Таблица 2). Напротив, в колбочках сплайсинг WT PRPh3 преимущественно приводил к несплицированной изоформе (87%, фиг. 2C). Умеренное различие между WT PRPh3 в палочках и колбочках может наблюдаться для удерживающей изоформы интрона 1 (22% в палочках против 11% в колбочках, рис. 2D). Затем мы сравнили относительный процент полос сплайсинга для одиночных мутантов PRPh3 с соответствующими WT, выраженными в палочках и колбочках. Не наблюдали вариабельности процентного содержания изоформы удерживания интрона 1 ни для одного из мутантов в палочках и колбочках (рис. 2D).Однако количество правильно сплайсированной изоформы было снижено до 51% для палочко-доминантной мутации G249S (Рис. 2E и Таблица 2). Это уменьшение, скорее всего, является результатом генерации нового донорского сайта, наблюдаемого для этого мутанта. Напротив, в колбочках три мутанта ( V209I , R195L и R220Q ) привели к сильному увеличению процента правильно сплайсированной изоформы PRPh3, что сопровождалось соответствующим уменьшением несплицированного транскрипта (рис. 2C и 2E и таблица 2).Взятые вместе, эти результаты указывают на специфические эффекты клеточного типа и мутации на сплайсинг мРНК PRPh3 в палочках и колбочках.
Количественный анализ нативных изоформ сплайсинга PRPh3
Эксперименты, показанные на фиг. 2A, были выполнены с использованием минигенов, которые содержат человеческий PRPh3, экспрессируемый в мышиных фоторецепторах. Однако можно предположить, что эндогенная численность отдельных изоформ сплайсинга PRPh3 может различаться в фоторецепторах человека и мыши, что, в свою очередь, затрудняет интерпретацию нашего анализа, основанного на минигене.Чтобы проверить, подходят ли мышиные фоторецепторы для анализа сплайсинга PRPh3 человека, мы исследовали эндогенные уровни изоформ сплайсинга PRPh3 в сетчатке человека и мыши с помощью qRT-PCR. С этой целью мы использовали два специфических набора праймеров для амплификации двух транскриптов PRPh3 человека или мыши, отражающих изоформы сплайсинга, полученные в экспериментах с минигенами (рис. 3А). Специфическую амплификацию несплицированного транскрипта PRPh3 оценивали с использованием праймеров, связывающихся с интронными областями, фланкирующими экзон 2 (P-us_F и P-us_R).Для обнаружения правильно сплайсированной изоформы PRPh3 мы использовали праймеры, связывающиеся с экзоном 1 и экзоном 3 (P-cs_F и P-cs_R). Из-за большого размера смежных нативных интронов (23 т.п.н. для интрона 1 и интрона 2 мыши, соответственно, 23 т.п.н., см. Рис. 1A и рис. 3A), изоформы PRPh3, несущие интроны, скорее всего, не амплифицируются при qRT. -Условия ПЦР. Для количественной оценки относительную экспрессию всех отдельных изоформ нормализовали по эндогенной синтазе аминолевулиновой кислоты (ALAS).Важно отметить, что обе комбинации праймеров привели к четко определяемым продуктам qPCR как в сетчатке человека, так и в сетчатке мыши, причем относительная экспрессия PRPh3 была немного выше для обеих комбинаций в сетчатке человека (фиг. 3B). Следует отметить, что, учитывая тот факт, что в сетчатке человека и мышей палочки составляют> 95% популяции фоторецепторов, ожидаемые результаты должны отражать сплайсинг минигенов PRPh3 в палочках. В соответствии с этим мы обнаружили, что правильно сплайсированная изоформа PRPh3 намного выше экспрессируется в нативной сетчатке по сравнению с несплайсированным вариантом (10.60 ± 0,68 против 0,21 ± 0,03 для человека и 5,60 ± 0,29 против 0,14 ± 0,03 для сетчатки мыши соответственно). Никаких различий между экспрессией PRPh3 человека и мыши не удалось обнаружить при построении графика отношения несплайсированных изоформ PRPh3 к соответствующим правильно сплайсированным изоформам PRPh3 (0,10 ± 0,01 для человека против 0,13 ± 0,02 для сетчатки мыши, соответственно (рис. 3C)). Взятые вместе, эти результаты убедительно показывают, что как в качественном, так и в количественном отношении сплайсинг PRPh3 очень похож в сетчатке человека и мыши.
Рис. 3. Количественная оценка изоформ сплайсинга PRPh3 в природных фоторецепторах человека и мыши.
(A) Точное масштабное представление экзонных и интронных областей человеческого PRPh3 (верхняя панель) и мышиного Prph3 (нижняя панель). Положения связывания праймеров, используемых для qRT-PCR, указаны стрелками. Для правильно сплайсированного человеческого PRPh3 или мышиного Prph3 (hP-cs или mP-cs) использовали комбинацию праймеров P-cs_F и P-cs_R. Для обнаружения несплицированного человеческого (hP-us) или мышиного (mP-us) варианта применяли комбинацию праймеров P-us_F и P-us_R.(B) qRT-PCR из объединенной тотальной РНК сетчатки человека (серые прямоугольники) или мыши (черные прямоугольники), выделенной из двух (человека) или четырех (мыши) биологических образцов. Единичные значения следующие: hP-cs, 10,60 ± 0,67; hP-us, 0,21 ± 0,03; mP-CS, 5,60 ± 0,29; мП-ус, 0,13 ± 0,03. Все данные представлены как средние значения, а полосы ошибок представляют собой SEM. Для каждой комбинации праймеров были проведены три технических повтора, и экспрессия была нормализована по синтазе аминолевулиновой кислоты (ALAS). (C) Относительные отношения, представленные как средние значения ± SEM отдельных несплицированных транскриптов к соответствующей правильно сплайсированной изоформе человека (0.10 ± 0,01) или сетчатки мыши (0,13 ± 0,02). Тест значимости проводился с помощью двустороннего t-критерия (p = 0,26). (D) анализ qRT-PCR из отсортированных мышиных палочек (красные прямоугольники) и колбочек (черные прямоугольники) соответственно. Для qRT-PCR использовали кДНК, полученные из объединенных палочек, отсортированных от шести животных (дающие 100000 клеток), и объединенные колбочки, отсортированные от четырех животных (дающие 27000 клеток). Синтез кДНК проводили с использованием идентичной общей концентрации РНК для палочек и колбочек, соответственно (50 нг каждая). Для оценки чистоты палочек и колбочек, отсортированных по FAC, использовали праймеры, специфичные для мышиного родопсина ( Rho ) и М-опсина ( Opn1mw ).Для обнаружения изоформ сплайсинга Prph3 применяли те же комбинации праймеров, как показано на фиг. 3A. Для каждой комбинации праймеров было проведено три технических повтора, и экспрессия была нормализована по синтазе аминолевулиновой кислоты домашнего хозяйства (Увы). Все данные представлены как средние значения, а полосы ошибок представляют собой SEM. Единичные значения для стержней, отсортированных по FAC, следующие: Rho, 146,90 ± 10,24; Opn1mw, 1,25 ± 0,16; P-cs, 16,67 ± 0,71; P-us, ± 0,95 ± 0,07. Экспрессия в отсортированных колбочках дала следующие значения: Rho, 5.27 ± 0,14; Opn1mw, 6,38 ± 0,13; P-cs, 5,45 ± 0,44; P-us, ± 2,71 ± 0,19. Штанги P-CS против конусов : p = 0,0002; Стержни P-us против конусов : p = 0,001. (E) Относительные отношения отдельных несплицированных транскриптов к соответствующей правильно сплайсированной изоформе из палочек или колбочек, отсортированных по FAC. Анализ значимости проводился с помощью двустороннего t-критерия (p = 0,0003).
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.g003
Наши результаты минигена PRPh3 показали, что колбочки значительно отличаются от стержней по относительному количеству правильно сращенных и несплайсированных вариантов PRPh3 (рис. 2A).Чтобы проверить, верно ли это и в естественном контексте, мы очистили палочки и колбочки от мышей в возрасте 6-8 недель с помощью флюоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) и впоследствии определили количество эндогенных изоформ сплайсинга мышиного Prph3 в отсортированных фоторецепторах [26, 27]. Чистота отсортированных фоторецепторов была подтверждена путем оценки уровней транскриптов клеточных типов генов родопсина ( Rho ) и М-опсина ( Opn1mw ) в качестве маркеров для палочек и колбочек, соответственно. По сравнению с палочками, отсортированными по FAC, отсортированные колбочки демонстрировали 28-кратное снижение экспрессии Rho, сопровождающееся 5-кратным увеличением экспрессии M-опсина (фиг. 3D).Это указывает на высокую чистоту отсортированных шишек, показывающую лишь небольшое загрязнение стержнями (около 3,6%). В соответствии с результатами qRT-PCR, показанными на рис. 3B для нативной сетчатки, в палочках, отсортированных с помощью FAC, мы обнаружили, что правильно сплайсированная изоформа Prph3 была намного выше экспрессирована по сравнению с вариантом без сплайсинга (16,67 ± 0,71 против 0,95 ± 0,07, рис. 3D). Напротив, в колбочках, отсортированных по FAC, экспрессия правильно сплайсированного Prph3 показывала только очень умеренное увеличение по сравнению с вариантом без сплайсинга (5.45 ± 0,44 против 2,71 ± 0,19). Одновременно эти данные также демонстрируют, что относительная экспрессия правильно сплайсированного Prph3 снижалась в колбочках, что сопровождалось увеличением экспрессии несплайсированного транскрипта Prph3. Эти различия в экспрессии одиночных изоформ Prph3 между палочками и колбочками становятся еще более очевидными при сравнении соотношений несплайсированных и правильно сплайсированных изоформ Prph3 между двумя типами клеток (0,06 ± 0,004 для стержней и 0.49 ± 0,04 для конусов соответственно (рис. 3Е)). Взятые вместе, эти данные в значительной степени совместимы с данными, наблюдаемыми на наших минигенах, и показывают, что относительные эндогенные уровни правильно сплайсированных и несплайсированных изоформ Prph3 значительно различаются между палочками и колбочками.
Изоформа PRPh3, кодируемая экзоном 1, неправильно локализована в фоторецепторах
Результаты, показанные на фиг. 1D и 1E, показывают, что производный от минигена, меченный флуорофором белок PRPh3 правильно экспрессируется и локализуется во внешних сегментах палочки и колбочки мыши.Однако, поскольку все изоформы сплайсинга PRPh3, полученные из минигена, несут флуорофор, обнаружение сигнала флуорофора не позволяет различить, какие из этих изоформ экспрессируются на уровне белка. Правильно сплайсированный, меченный флуорофором PRPh3 приводит к полноразмерному белку, который, как известно, правильно локализуется во внешних сегментах [28]. Однако оставшиеся две изоформы сплайсинга PRPh3 (несплайсированные и сохраненные в интроне 1) несут преждевременный стоп-кодон сразу после экзона 1, и их экспрессия не анализировалась в предыдущих исследованиях.Трансляция этих двух транскриптов PRPh3 будет приводить к усеченному белку PRPh3, лишенному дистальной половины петли D2, TM4 и нижестоящей последовательности (фиг. 4A и S2, фиг. Панель C). Что касается трансляции и экспрессии белка этих изоформ PRPh3, в принципе можно предположить четыре различных возможности: i) Две изоформы сплайсинга транслируются в белок, и белок является стабильным, но неправильно локализован во внутренних сегментах. ii) Две изоформы сплайсинга транслируются в белок, и белок правильно локализуется.iii) Они переводятся в белок, но белок разрушается. iv) Они не транслируются в белок, но расщепляются на уровне мРНК, то есть посредством механизма нонсенс-опосредованного распада мРНК (NMD), который требует присутствия преждевременного стоп-кодона в мРНК. Первую возможность можно исключить, поскольку мы не наблюдаем какой-либо неправильно локализованный белок в трансдуцированных фоторецепторах при экспрессии минигена WT PRPh3. Чтобы различать оставшиеся три сценария, мы выразили вариант PRPh3, который несет стоп-кодон сразу после экзона 1 и, следовательно, отражает белок, транслируемый из несплайсированного транскрипта или транскрипта, удерживающего интрон 1 (см.S2 Рис, панель C). Однако, в отличие от двух изоформ сплайсинга PRPh3, происходящих из минигена, этот вариант не содержит преждевременного стоп-кодона и, таким образом, мРНК не может расщепляться посредством механизма NMD. Экспрессия усеченного PRPh3 в фоторецепторах палочек или колбочек приводит к белку, который сильно экспрессируется, но полностью неправильно локализован во внутренних сегментах (рис. 4B и 4C). Таким образом, сценарий ii) или iii), предполагающий правильную локализацию или деградацию белка этой изоформы PRPh3, может быть исключен.На основании этих результатов мы заключаем, что две изоформы сплайсинга, несущие преждевременный стоп-кодон, не транслируются в белок, предположительно из-за деградации мРНК через механизм NMD.
Рис. 4. Нарушение нацеливания усеченного PRPh3.
Иммуногистология трансдуцированных сетчаток мышей, показывающая палочковую (B) и конус-специфичную (C) экспрессию усеченной версии PRPh3. (A) Усеченный PRPh3 содержит только экзон 1 и расположенный ниже стоп-кодон (обозначенный «X»), имитирующий трансляцию из несплицированной мРНК PRPh3 и мРНК PRPh3 с сохранением интрона 1.Окрашивание на B1a и M-ops использовали для маркировки фоторецепторов палочек и колбочек соответственно. Усеченный PRPh3 не транспортируется во внешние сегменты и почти исключительно присутствует во внутренних сегментах и сомах фоторецепторов. Масштабная линейка соответствует 20 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.g004
Экспрессия белка и локализация мутантов PRPh3 в палочках и колбочках
Затем мы использовали rAAV-векторы минигена PRPh3 для анализа экспрессии белка и локализации в сетчатке мутантов PRPh3, связанных с болезнями колбочек (рис. 5).Все пять мутантов продуцировали значительные уровни белков, которые были правильно локализованы на внешних сегментах колбочек (рис. 5A – 5E). При Вестерн-блот-анализе мутантные белки мигрировали с размером полноразмерного PRPh3 дикого типа (приблизительно 66,5 кДа), однако уровни экспрессии различались между различными мутантами и белками дикого типа (фиг. 5F). В частности, мы обнаружили устойчивое увеличение экспрессии белка для мутантов V209I , R195L и R220Q по сравнению с WT PRPh3 (рис. 5F и 5G).Эти находки согласуются с сильно увеличенной эффективностью сплайсинга этих трех мутантов, приводящей к более высоким уровням правильно сплайсированного PRPh3 в колбочках (см. Рис. 2). В отличие от единообразного поведения «конус-специфичных» мутаций PRPh3, «палочко-специфичные» мутанты PRPh3, сцепленные с adRP, выявляют более разнообразные эффекты. В частности, для мутанта C214S , чье влияние на локализацию белка также было исследовано ранее [29], мы подтвердили серьезную неправильную локализацию белка во внутреннем сегменте и по всей фоторецепторной клетке (рис. 6А).Подобно C214S , мы обнаружили, что также мутант P210L приводит к массивной неправильной локализации внутреннего сегмента (рис. 6B). Однако, в отличие от мутанта C214S , который показал равномерную картину цитозольного распределения, мутант P210L был обнаружен в больших и пятнистых везикулярных структурах. В дополнение к этим результатам, анализ вестерн-блоттинга выявил более или менее выраженное снижение экспрессии белка для четырех мутаций PRPh3, связанных с adRP (рис. 6G и 6H).Наиболее сильное снижение наблюдалось для мутанта C214S и для мутанта S198R , за которым следовали мутации P210L и G249S . Напротив, два других проанализированных мутанта привели к уровням белка дикого типа (рис. 6G и 6H). Интересно, что два мутанта ( S198R и P210L ) показали дополнительные прибл. Полоса 42 кДа на Вестерн-блоте, скорее всего, является результатом деградации белка. Такая деградация была описана для мутаций, вызывающих неправильную укладку белка, что может привести к доступности для конкретного сайта расщепления протеазой, который скрыт в нативном белке.Полоса 42 кДа не может быть обнаружена для мутации C214S и G249S , что позволяет предположить, что различные механизмы могут вызывать снижение уровней белка этих мутантов PRPh3. Умеренное снижение экспрессии белка мутанта G249S , вероятно, вызвано уменьшением относительного количества правильно сплайсированного транскрипта PRPh3 из-за создания нового донорского сайта сплайсинга, как показано на фиг. 2A. Соответственно, полученный мутантный белок G249S несет делецию из 30 аминокислот, покрывающую наиболее дистальную часть домена петли D2 и проксимальную половину трансмембранного домена 4 (фиг. 2B и S2, фиг. Панель B).Ожидается, что эта делеция приведет к сдвигу на 3,5 кДа, что приведет к расчетной молекулярной массе 63 кДа. Однако не было обнаружено полосы для мутанта G249S с этой молекулярной массой, что указывает на то, что изоформа с аберрантным сплайсингом разрушается либо на уровне мРНК, либо на уровне белка. Таким образом, несмотря на замечательную вариабельность механизмов одного заболевания, наблюдаемую для четырех из шести описанных выше мутантов, ассоциированных с adRP, их наиболее общим признаком является то, что все они приводят к снижению экспрессии белка во внешних сегментах палочек.Следует отметить, что различия в экспрессии белка, показанные на фиг. 5G и фиг. 6H, также могут быть результатом индивидуальных различий в размере областей инъекции или различий в эффективности вирусной трансдукции между конструкциями. Чтобы исключить эти возможности, мы провели две серии экспериментов. Во-первых, используя фотографию глазного дна, мы показываем, что размер инъецированных областей был сопоставим для одиночных мутантов и WT PRPh3 в палочках и колбочках, всегда покрывающих прибл. 1/3 всей сетчатки (S4 рис.).Во-вторых, мы пришли к выводу, что потенциальные различия в эффективности трансдукции также должны приводить к различиям в сумме интенсивностей отдельных транскриптов между минигенами PRPh3, полученными в результате анализа RT-PCR. Однако при сравнении суммы интенсивностей полос для одиночных конструкций PRPh3 в палочках или колбочках не удалось обнаружить существенной вариабельности (S5, фиг.). Следовательно, мы заключаем, что дифференциальные эффекты отдельных мутантов PRPh3 на экспрессию белка отражают внутренние свойства мутантов и, скорее всего, не вызваны техническими проблемами.
Рис. 5. Экспрессия в сетчатке мутантов PRPh3, связанных с болезнями колбочек.
(A-E) Иммуногистологический анализ сетчатки, трансдуцированной минигенами PRPh3, несущими одноточечные мутации под контролем промотора mSWS, как указано. Масштабная линейка соответствует 20 мкм. (F) Вестерн-блоттинг препаратов мембран сетчатки мышей, трансдуцированных минигенами PRPh3, показанными на A-E. Вестерн-блоттинг проводился с использованием четырех объединенных сетчаток четырех животных, которым инъецировали P14.Все сетчатки собирали через три недели после инъекции. Ctrl, белковые лизаты из контрольных сетчаток без инъекций. PRPh3 был обнаружен антителом против GFP, которое распознало цитриновую метку. В качестве контроля загрузки использовали антитело против мышиной альфа-субъединицы АТФазы (анти-АТФазы). (G) Полуколичественный анализ результатов, показанных в (F). Для количественной оценки были проведены три технических повтора, и экспрессия PRPh3 была нормализована до экспрессии АТФазы. Все данные представлены как средние значения ± SEM.Статистический анализ проводился с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Данетта. *, р <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001. n.s., не имеет значения.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.g005
Рис. 6. Экспрессия белка мутантов PRPh3, связанных с adRP.
(A-F) Иммуногистология сетчатки, трансдуцированной минигенами PRPh3, содержащими одноточечные мутации, как указано под контролем промотора hRHO. Масштабная линейка соответствует 20 мкм.(G) Вестерн-блот-анализ мембранных препаратов четырех объединенных сетчаток мышей от четырех животных, трансдуцированных минигенами PRPh3, показанными в (A-F) на P14. Все сетчатки собирали через три недели после инъекции. Стрелка указывает полосу деградации, обнаруженную при 42 кДа. Ctrl, белковые лизаты из контрольных сетчаток без инъекций. (H) Полуколичественный анализ результатов, показанных в (G). Для количественной оценки были проведены три технических повтора, и экспрессия PRPh3 была нормализована до экспрессии АТФазы.Все данные представлены как средние значения, а полосы ошибок представляют собой SEM. Статистический анализ проводился с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Данетта. *, р <0,05; **, p <0,01; ***, р <0,001. n.s., не имеет значения.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.g006
Сплайсинг и экспрессия белка палочко-доминантного мутанта PRPh3 в колбочках и мутантного доминантного конуса в палочках
До сих пор анализ сплайсинга и экспрессии белка мутаций PRPh3, связанных с дефектами палочек или колбочек, проводился исключительно для того типа фоторецепторов, на который, как сообщается, повлияла данная мутация.Чтобы исключить возможность того, что мутации также влияют на сплайсинг или экспрессию белка в типе фоторецепторов, который в первую очередь не нарушен мутацией, мы экспрессировали палочковидную мутацию W246R в колбочках и мутантную доминантную колбочку R220W в палочках, соответственно. . Однако уровни локализации белка, сплайсинга и экспрессии белка обоих мутантов казались нормальными и были неотличимы от соответствующего дикого типа (S6 фиг.).
Обсуждение
В этом исследовании, используя минигены, экспрессирующие человеческий WT и одиннадцать точечных мутантов PRPh3 в мышиных фоторецепторах, мы раскрываем новую роль сплайсинга мРНК в экспрессии белка PRPh3 в палочках и колбочках.Анализ транскриптов PRPh3 в сетчатке мышей, трансдуцированных минигенами PRPh3, на основе ОТ-ПЦР выявил три различные изоформы сплайсинга PRPh3 в палочках и колбочках. Эти изоформы сплайсинга включают несплайсированный транскрипт, удерживание интрона 1 и правильно сплайсированный PRPh3. Важно отметить, что мы подтвердили существование несплицированной изоформы с помощью qRT-PCR из нативной сетчатки человека и мыши и отсортированных по FAC мышиных палочек и колбочек. Более того, анализ относительного количества несплайсированных и правильно сплайсированных изоформ PRPh3 в отсортированных палочках и колбочках предполагает, что, по сравнению с палочками, колбочки экспрессируют более низкие количества правильно сплайсированного и более высокие количества несплайсированного транскрипта PRPh3.Кроме того, мы обнаружили, что только правильно сплайсированная изоформа транслировалась в белок, тогда как оставшиеся две изоформы сплайсинга, вероятно, деградировали на уровне мРНК. Это указывает на то, что в колбочках альтернативный сплайсинг мРНК может представлять механизм, который эволюционировал, чтобы поддерживать экспрессию белка PRPh3 на довольно низком уровне. В настоящее время можно только догадываться, почему колбочки стремятся к меньшему количеству PRPh3, и необходимы долгосрочные исследования (например, на животных с нокаутом, несущими соответствующие мутанты с доминантой колбочек), чтобы выяснить точную функцию дифференциальных уровней экспрессии PRPh3 в фоторецепторах. .Сравнение паттерна сплайсинга и экспрессии белка мутантов PRPh3 в палочках и колбочках выявило новую корреляцию генотип-фенотип (Таблица 3). Три из пяти мутантов, связанных с нарушениями колбочек, приводили к значительному увеличению относительного количества правильно сплайсированного транскрипта PRPh3 по сравнению с WT в колбочках. Это повышение эффективности сплайсинга мРНК сопровождалось увеличением экспрессии белка, что видно при иммуноокрашивании и вестерн-блоттинге трансдуцированных сетчаток.Ни один из мутантов PRPh3 с доминированием конуса не влиял на локализацию белка или характер экспрессии белка. В предыдущем исследовании было показано, что очень умеренная сверхэкспрессия PRPh3 в колбочках (50%) не влияет на их морфологию и функцию [30]. Однако наши результаты предполагают, что некоторые точечные мутанты PRPh3 могут вызывать очень сильную сверхэкспрессию, которая может оказывать пагубное воздействие на колбочки. Два из проанализированных здесь мутантов PRPh3 с доминантным конусом ( S212T и R220W ) не проявили каких-либо эффектов на сплайсинг и экспрессию белка.Это предполагает, что сверхэкспрессия белка не является универсальным механизмом, достаточным для объяснения пенетрантности всех мутантов PRPh3, связанных с болезнью колбочек. В соответствии с этим, недавнее исследование, анализирующее другую мутацию петли D2 колбочек, связанную с заболеванием, в PRPh3 ( R172W ) выявило пагубные эффекты этой мутации на колбочки, не влияя на экспрессию белка [31]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, лежит ли в основе наблюдаемого фенотипа заболевания гиперэкспрессия белка сама по себе, функциональный дефект, вызванный мутацией PRPh3, или комбинация обоих механизмов.
В отличие от мутантов PRPh3 в колбочках, четыре из шести мутантов, связанных с adRP, приводили к снижению экспрессии белка во внешних сегментах палочек с помощью различных механизмов. Эти механизмы включают аберрантный сплайсинг мРНК, неправильную локализацию белка и деградацию белка (Таблица 3). Единственным мутантом, влияющим на сплайсинг мРНК в стержнях, была мутация G249S . Этот мутант приводит к образованию нового донорного сайта в экзоне 2, тем самым снижая экспрессию по сравнению с правильно сплайсированным PRPh3 примерно на 20%.Примечательно, что только правильно сплайсированный PRPh3 экспрессировался на уровне белка, тогда как оставшиеся две изоформы, по-видимому, деградировали на уровне мРНК, предположительно посредством механизма NMD. В предыдущем исследовании на трансгенных мышах было показано, что критический уровень экспрессии PRPh3, необходимый для поддержания правильной морфологии и функции палочек, составляет около 80% от экспрессии нативного PRPh3 [30]. Таким образом, снижение экспрессии белка на 20%, вызванное мутацией G249S , очень близко к этому критическому уровню и может быть достаточным, чтобы вызвать дегенерацию сетчатки у пораженного пациента.
Недавно было показано, что сплайсинг мРНК BBS8, гена, дефекты которого связаны с синдромом Барде-Бидла, различается по палочкам и колбочкам [32]. Этот вывод и результаты нашего исследования предполагают, что в стержнях и конусах компоненты сварочного оборудования различны. Представляется возможным, что колбочки экспрессируют подмножество экзонных / интронных энхансеров или глушителей, которые не присутствуют в стержнях, и наоборот. В соответствии с этой гипотезой было обнаружено, что некоторые известные ESE (такие как SC35, кодируемые геном SFRS2), а также ESS hnRNPA1 были выше экспрессированы на уровне транскрипта в палочках по сравнению с колбочками [33] (http: // www.fmi.ch/roska.data/index.php). В дополнение к данным транскрипции, тщательный анализ протеома палочек и колбочек может помочь идентифицировать молекулярные компоненты, которые опосредуют дифференциальное сращивание палочек и колбочек. Поскольку делеция интронных областей также может привести к нарушению существующих регуляторных элементов сплайсинга интронов [34, 35], мы не можем исключить возможность того, что отсутствие полноразмерных нативных интронов в минигенах PRPh3, используемых в этом исследовании, также может влиять на сплайсинг мРНК. . Длина нативных интронов PRPh3 намного превышает клонирующую способность вирусных векторов, обычно используемых для трансдукции фоторецепторов.Альтернативные подходы для вставки больших трансгенов в фоторецепторы (например, электропорация) очень ограничены с точки зрения их эффективности [13]. Однако высокая эффективность имеет решающее значение для анализа экспрессии в колбочках, которые составляют очень небольшой процент популяции фоторецепторов. Таким образом, с технической точки зрения, rAAV-опосредованный перенос генов в настоящее время представляется наиболее подходящим методом для анализа сплайсинга и экспрессии белков в фоторецепторах.
Насколько нам известно, это первое исследование, демонстрирующее экспериментальный план, который позволяет проводить систематический анализ точечных мутаций, связанных с заболеванием, при сплайсинге и экспрессии белка в фоторецепторах для одного гена.Наши результаты предполагают, что дифференциальный сплайсинг PRPh3 в палочках и колбочках может влиять на механизмы болезни, связанные с одноточечными мутациями на уровне транскрипта. Таким образом, потенциальные эффекты точечных мутаций на сплайсинг в палочках и колбочках могли быть недооценены до сих пор и должны быть проверены на другие точечные мутации в PRPh3, а также на мутации в других генах, участвующих в структурной и функциональной целостности фоторецепторов. Наконец, дифференциальное влияние точечных мутаций PRPh3 на экспрессию белков во внешних сегментах может помочь объяснить разнообразную пенетрантность одиночных мутаций PRPh3 в палочках и колбочках.
Материалы и методы
Заявление об этике
Посмертные образцы сетчатки человека, использованные в этом исследовании, получены от доноров органов с явного информированного согласия и одобрения местного этического комитета на использование тканей в исследовательских целях.
Животные
Все процедуры в отношении животных проводились с разрешения местных властей (Regierung von Oberbayern). Анестезию выполняли подкожной инъекцией кетамина (40 мг / кг веса тела) и ксилазина (20 мг / кг веса тела).Эвтаназию проводили путем шейного вывиха.
Конструирование и клонирование минигенов PRPh3
Для генерации минигенов PRPh3 три перекрывающихся продукта, содержащие ДНК-фрагменты с полноразмерными экзонами и укороченные интроны PRPh3, амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК человека, выделенной у одного из авторов этого исследования (Эльвир Бекирович). Фрагменты ПЦР собирали с использованием стандартных методик перекрывающейся ПЦР и субклонировали в вектор экспрессии pcDNA3.1 (Invitrogen).Впоследствии цитрин был субклонирован 5 ’к экзону 1 PRPh3. Одиночные точечные мутанты PRPh3 получали с помощью сайт-направленного мутагенеза (QuikChange Lightning Mutagenesis Kit, Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Для экспрессии в палочках и колбочках отдельные минигены PRPh3 субклонировали в вектор pAAV2 / 8, содержащий промотор родопсина человека (hRHO) или S-опсина мыши (mSWS). Общая длина вставки между инвертированными концевыми повторами (ITR), включая промотор, миниген PRPh3 и последовательность полиА BGH, составляла 4.7 т.п.н. для вектора, содержащего промотор hRHO, и 4,4 т.п.н. для вектора pAAV, несущего промотор mSWS. Все минигены PRPh3 были полностью секвенированы перед использованием.
In silico предсказание сварки
Для прогнозирования сплайсинга одиночных точечных мутантов PRPh3 используется бесплатная пробная версия программного обеспечения для сплайсинга ASSEDA (splice.uwo.ca/) и открытый доступ NNSplice (Berkeley Drosophila Genome Project, http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice. html).
Сплайс-анализ и количественное определение изоформ, полученных из минигена PRPh3, в стержнях и колбочках
Для анализа сращивания палочек и колбочек мышам вводили инъекцию на P14.Через три недели после инъекции соответствующих минигенов PRPh3 сетчатку сканировали на флуоресценцию с помощью фотографии глазного дна (Spectralis, Heidelberg Eye Instruments). Впоследствии четыре из рассеченных флуоресцентных сетчаток для каждого минигена PRPh3 были объединены и использованы для выделения РНК. Выделение РНК из инъецированных фоторецепторов проводили с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Равные концентрации (1 мкг) выделенной общей РНК из каждого образца применяли для последующего синтеза кДНК (Revert Aid First Strand cDNA Sythesis Kit, Life Technologies).Для амплификации изоформ сплайсинга, полученных из минигенов PRPh3 с помощью ПЦР, были использованы следующие праймеры:
5’-GGCATGGACGAGCTATACAAG-3 ‘
5’-GGTTGGACACACCATCCAGCG-3 ‘
Отдельные продукты ПЦР, представляющие различные изоформы сплайсинга, были извлечены, очищены и секвенированы. Все эксперименты на отдельных типах клеток, касающиеся выделения тотальной РНК, синтеза кДНК и последующей ПЦР, проводили в один и тот же день в одних и тех же условиях. Для полуколичественного анализа отдельных минигенов PRPh3 было проведено пять реакций ОТ-ПЦР с использованием кДНК, описанной выше, с переменным числом циклов в диапазоне от 25 до 27 циклов для амплификации минигенов PRPh3, несущих промотор hRHO, и 30-32 циклов для амплификация минигенов PRPh3, несущих промотор mSWS, соответственно.Статистический анализ проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Данетта для множественных сравнений отдельных мутантов PRPh3 с соответствующими PRPh3 дикого типа в палочках и колбочках. Абсолютные интенсивности отдельных полос сплайсинга определяли с использованием программного обеспечения Image Lab (BioRad). Экспериментальные условия и тип анализа данных для полуколичественного анализа RT-PCR отдельных минигенов PRPh3, показанных на S6 фиг., Были идентичны описанным для фиг. 2, за исключением количества технических повторов (три на S6 фиг. Рис 2).
Производство rAAV и субретинальные инъекции
Минигены PRPh3 были субклонированы в одноцепочечный вектор pAAV2.1, содержащий промотор hRHO или mSWS [36, 37]. Подробные процедуры получения rAAV и субретинальных инъекций были описаны ранее [36]. Соответствующие титру rAAV (10 ⁹ частиц / мкл), содержащие отдельные минигены PRPh3, были субретинально инъецированы животным WT C57 BL / 6J на 14-й день после рождения. Через три недели после инъекции все введенные сетчатки были проанализированы на флуоресценцию с помощью сканирующего лазера. офтальмоскопия (Spectralis, Heidelberg Eye Instruments).
Иммуногистология и вестерн-блоттинг
Для иммуногистологии мышам инъецировали на Р14 соответствующие минигены PRPh3. Через три недели после инъекции сетчатку вскрывали и обрабатывали для иммуногистологии, как описано [38]. Мы использовали кроличьи антитела против CNGB1a (1: 2000, [39]) и кроличьи антитела против M-опсина (1: 300, [38]) в качестве маркеров для наружных сегментов палочки и колбочки, соответственно. Изображения сетчатки получали с помощью конфокального сканирующего микроскопа TCS SP8 (Leica), получали с помощью программного обеспечения LASAF (Leica) и обрабатывали с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения).Для обнаружения белка с помощью вестерн-блоттинга для каждой из конструкций мы использовали четыре объединенных сетчатки от четырех мышей, которым инъецировали на P14 минигены PRPh3 с соответствующим титром, несущие промотор hRHO или mSWS. Мембранные препараты были выполнены через три недели после инъекции, как описано [40], и белки были разделены на 6–12% градиентном геле SDS PAGE. Для обнаружения белков, меченных цитрином, использовали моноклональные мышиные антитела против GFP (1: 1000, Clontech). Для обнаружения АТФазы Na ⁺ / K ⁺ мы использовали мышиное антитело против a6F-c в разведении 1: 1000 (Developmental Studies Hybridoma Banks, University of Iowa).Для полуколичественного анализа было проведено три технических повтора с мембранных препаратов. Абсолютные интенсивности отдельных полос белка определяли с помощью программного обеспечения Image Lab (BioRad). Интенсивности полос для каждого белка PRPh3, полученного из минигена, нормализовали до соответствующей интенсивности АТФазы.
FAC-сортировка стержней и конусов
Сетчатки были выделены из нейральной сетчатки мышей с лейциновой застежкой-молнией (Nrl) EGFP [26] или cone-GFP [27] репортерных мышей. У мышей Nrl-EGFP EGFP управляется стержневым промотором Nrl.У мышей cone-GFP экспрессия GFP управляется 5′-регуляторной последовательностью гена красного / зеленого опсина человека. Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с законами ЕС и Германии (Tierschutzgesetz) и Положением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. От каждой репортерной мыши выделяли две сетчатки на взрослой стадии (6-8 недель) и диссоциировали с использованием системы диссоциации папаина (Worthington Biochemical Corporation, Лейквуд, США) в течение 20 минут со 100 мкг / мл папаина в соответствии с инструкциями производителя.Диссоциированные клетки были отсортированы (BD FACSAria II SORP, BD Bioscience), и клетки были собраны на основании их репортерной флуоресценции.
Выделение РНК и синтез кДНК
РНК из очищенных FACS фоторецепторов палочек и колбочек и из нативной сетчатки человека и мыши экстрагировали с использованием RNeasy Minikit (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и чистоту РНК определяли с помощью NanoDrop2000 (Thermo Scientific). Для синтеза кДНК из нативной сетчатки человека (два донора) и мыши (четыре животных) использовали общую РНК в количестве 500 нг.Для синтеза кДНК из отсортированных мышиных палочек и колбочек применяли 50 нг изолированной тотальной РНК.
Количественная ПЦР
ПЦР
выполняли в системе для ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems) с использованием SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems). Для количественной ПЦР мы выполнили три технических повтора для каждого гена и нормализовали каждый из них до экспрессии синтазы аминолевулиновой кислоты гена домашнего хозяйства (Увы). Для обнаружения мышиных транскриптов использовали следующие праймеры:
Увы, fwd: 5’-TCGCCGATGCCCATTCTTATC-3 ‘
Увы, рев: 5’-GGCCCCAACTTCCATCATCT-3 ‘
Rhodopsin fwd: 5’-GCCTCGAGAGCCGCAGCCATG-3 ‘
Rhodopsin rev: 5’-GCAGGAACATGTACGCTGCC-3 ‘
M-опсин fwd: 5’-GTTCCAGAGACAGTTTTCTAC-3 ‘
M-opsin rev: 5’-CAACGACCACAAGAATCATCC-3 ‘
мП-cs_F: 5’- TCTCCTCCAAGGAGGTCAAAG -3 ‘
мП-cs_R: 5’- GAGTCCGGCAGTGATGCTCAC -3 ‘
мП-us_F: 5’- GGGAGGATCTGCTGCTTGGTG -3 ‘
mP-us_R: 5’- GCTCACCAGGTCTGTCTTCAC -3 ‘
Для обнаружения человеческих транскриптов использовали следующие праймеры:
ALAS fwd: 5’-GATGTCAGCCACCTCAGAGAAC-3 ‘
ALAS rev: 5’-CATCCACGAAGGTGATTGCTCC-3 ‘
hP-cs_F: 5’-GTGGATCAGCAATCGCTACC -3 ‘
hP-cs_R: 5’-GGTTGGACACACCATCCAGCG -3 ‘
hP-us_F: 5’-GAAGTGGCCCCTGTTGAGAAG -3 ‘
hP-us_R: 5’-CATTAGACCCAAATGGGACCG -3 ‘.
Дополнительная информация
S1 Рис. Точечные мутации в PRPh3, связанные со специфическим заболеванием экзона 2.
Слева область PRPh3, кодируемая экзоном 2, показана пунктирным прямоугольником. Справа, схематическое увеличение части, кодируемой экзоном 2. Известные на данный момент позиции точечных мутаций выделены зеленым. Стрелки указывают на мутации, влияющие на аминокислоты, проанализированные в этом исследовании. Среди них черные стрелки указывают на мутации, связанные с болезнями колбочек, а красные стрелки указывают на мутации, связанные с adRP.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.s001
(TIF)
S2 Рис. Анализ репрезентативной последовательности продуктов сплайсинга PRPh3.
(A) Результаты секвенирования границ экзонов из правильно сплайсированного транскрипта PRPh3. Внизу слева топология правильно склеенного ПРФ3. Область, кодируемая экзоном 2, показана пунктирным прямоугольником. N, N-конец, C, C-конец. (B) Результаты секвенирования мутанта G249S . Верхняя панель, схема, показывающая мутант G249S до (вверху) и после сплайсинга (внизу).Нижняя панель слева, предсказывает влияние аберрантно сплайсированного G249S на уровень белка. Создание нового донорного сайта сплайсинга (DS) приводит к делеции в рамке считывания 30 аминокислот (аа), покрывающих часть PRPh3, обозначенную коричневым прозрачным прямоугольником. В центре и справа электрофореграммы, показывающие влияние мутанта G249S до и после сплайсинга. Положение нового донорского сайта сплайсинга показано стрелкой, а положение мутации обозначено стрелкой.(C) Удержание интрона 1 и несплайсированного транскрипта PRPh3 приводит к сдвигу рамки считывания с последующим стоп-кодоном сразу после экзона 1. Соответствующий белок не имеет дистальной половины петли D2, трансмембранного домена 4 и С-конца (внизу). левый). Все реакции секвенирования проводили на полосах, выделенных из сетчатки мыши после вирусной трансфекции минигенами PRPh3 (рис. 2).
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.s002
(TIF)
S3 Рис. Определение диапазона линейной амплификации ОТ-ПЦР для минигенов PRPh3.
Типичный образец qRT-PCR из сетчатки, в которую вводили минигены WT PRPh3, несущие палочковидный промотор hRHO (rP-mg) или конусный mSWS (cP-mg). Для qRT-PCR использовали те же объединенные образцы сетчатки и те же праймеры, как описано на фиг. 2B. Пунктирные линии представляют собой окно циклов, попадающих в линейный диапазон амплификации для rP-mg (20–28 циклов, пурпурный) и cP-mg (26–33 цикла, зеленый), соответственно.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.s003
(TIF)
S4 Рис.Репрезентативная фотография глазного дна сетчатки мыши, инъецированной одиночными минигенами PRPh3.
Фотографии глазного дна получали через три недели после инъекции на мышах дикого типа, которым в возрасте двух недель вводили одиночные минигены PRPh3 под контролем конус-специфичного промотора mSWS (A) или палочко-специфического промотора hRHO (B). Масштабная линейка представляет 800 мкм.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.s004
(TIF)
S5 Рис. Сумма абсолютных интенсивностей полос минигенов PRPh3 в палочках и колбочках.
Данные показывают общую сумму абсолютных интенсивностей всех полос, обнаруженных для каждого минигена PRPh3 из пяти технических повторов, показанных в экспериментах RT-PCR на фиг. 2A. Столбики представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего, полученные для расчета относительных процентов, показанных на рис. 2C – 2E. Статистический анализ (мутанты PRPh3 против , соответствующие WT в палочках и колбочках, соответственно) выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Данетта. *, р <0,05; **, p <0,01; ***, р <0.001. n.s., не имеет значения.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.s005
(TIF)
S6 Рис. Перекрестная экспрессия одного палочко-доминантного мутанта PRPh3 в колбочках и одного конус-доминантного мутанта в палочках.
Локализация белка (A, F), сплайсинг мРНК (B, C, G, H) и экспрессия белка (D, E, I, J) доминантной колбочковой мутации R220W мутации в палочках (AE) и палочке -доминантная мутация W246R в колбочках (FJ). Условия эксперимента (возраст инъецированных мышей, иммуномаркировка срезов сетчатки, момент времени выделения РНК, количество циклов, используемых для ОТ-ПЦР, количество инъецированных животных, момент времени выделения белка, тип представления данных) идентичны условиям описанные для соответствующих экспериментов на рис. 1, 2, 5 и 6.Для полуколичественного анализа сплайсинга мРНК (C, H) и экспрессии белка (E, J) в палочках и колбочках были проведены три технических повтора. Статистические данные рассчитывались с использованием двустороннего t-критерия. p-значения, показанные на C, H, E и J, следующие: C, p _{без сращивания} = 0,91, p _{с правильным сращиванием} = 0,76; H, p _{несращенный} = 0,74, p _{правильно соединенный} = 0,87; E, p = 0,39; Дж, р = 0,25. Масштабная линейка в A, F представляет 20 мкм.
https://doi.org/10.1371 / journal.pgen.1005811.s006
(TIF)
S1 Таблица.
In silico сплайсинговый анализ 30 точечных мутаций в экзоне 2 PRPh3.
Для анализа сплайсинга с использованием программного обеспечения для прогнозирования ASSEDA использовали 40 п.н., фланкирующих соответствующую мутацию. Все изменения для отдельных элементов сплайсинга или донорных и акцепторных сайтов показаны как кратные изменения WT. Для прогнозирования на основе NNSplice отдельные оценки даются для WT PRPh3, и изменения в этой оценке для мутантов выделяются синим цветом.↑ или ↓, увеличение или уменьшение оценки для данной последовательности распознавания или для донорного и акцепторного сайтов, соответственно. Цифры рядом с этими символами представляют собой кратное изменение WT. AS, акцепторный сайт сплайсинга, DS, донорный сайт сплайсинга, n.c., без изменений. Положение соответствующего акцепторного или донорного сайта сплайсинга (AG и GT, соответственно) в данной последовательности ДНК показано красным. SF2 / ASF, SC35, SRp40 и SRp55, белки, богатые серином / аргинином (SR), принадлежащие к энхансеру экзонного сплайсинга (ESE).hnRNPA1, белки, принадлежащие к сайленсеру экзонного сплайсинга (ESS). И отмена согласованной последовательности ESE, и создание новой последовательности распознавания для ESS может привести к пропуску экзона или сохранению интрона.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005811.s007
(XLSX)
Благодарности
Благодарим Берита Ноак за ценную техническую поддержку.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: EB.Проведены эксперименты: ЭБ СБ ОНПН ЛМР ЭС МАК ЦФ ОБ. Проанализированы данные: ЭБ ОНПН СК ЛМР СМ МБ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: EB MA SM MB. Написал статью: EB SM MB.
Список литературы
1. Гольдберг А.Ф. Роль периферина / rds в архитектуре фоторецепторов позвоночных и наследственных дегенерациях сетчатки. Int Rev Cytol. 2006. 253: 131–175. pmid: 17098056
2. Конли С. М., Застрявший М. В., Нааш М. И.. Структурные и функциональные отношения между фоторецепторными тетраспанинами и другими членами надсемейства.Cell Mol Life Sci. 2012. 69 (7): 1035–1047. pmid: 21655915
3. Бун CJ, ден Холландер AI, Hoyng CB, Cremers FP, Klevering BJ, Keunen JE. Спектр дистрофий сетчатки, вызванных мутациями в гене периферина / RDS. Prog Retin Eye Res. 2008. 27 (2): 213–235. pmid: 18328765
4. Ван Г.С., Купер Т.А. Сплайсинг при болезни: нарушение кода сплайсинга и механизма декодирования. Nat Rev Genet. 2007. 8 (10): 749–761. pmid: 17726481
5. Бечирович Э., Эберманн I, Надь Д., Зреннер Э., Селигер М.В., Больц Х.Дж.Синдром Ушера типа 1, обусловленный миссенс-мутациями на обоих аллелях CDh33: исследование сплайсинга мРНК. Hum Mutat. 2008; 29 (3): 452.
6. Cartegni L, Krainer AR. Нарушение SF2 / ASF-зависимого энхансера экзонного сплайсинга в SMN2 вызывает спинальную мышечную атрофию в отсутствие SMN1. Нат Жене. 2002. 30 (4): 377–384. pmid: 114
7. Лю HX, Cartegni L, Zhang MQ, Krainer AR. Механизм пропуска экзона, вызванный бессмысленными или миссенс-мутациями в BRCA1 и других генах.Нат Жене. 2001. 27 (1): 55–58. pmid: 11137998
8. Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Слушать тишину и понимать чепуху: экзонные мутации, влияющие на сплайсинг. Nat Rev Genet. 2002. 3 (4): 285–298. pmid: 11967553
9. Fairbrother WG, Yeh RF, Sharp PA, Burge CB. Прогностическая идентификация энхансеров экзонного сплайсинга в генах человека. Наука. 2002. 297 (5583): 1007–1013. pmid: 12114529
10. Pagani F, Baralle FE. Геномные варианты экзонов и интронов: определение спойлеров сплайсинга.Nat Rev Genet. 2004. 5 (5): 389–396. pmid: 15168696
11. Ван Э.Т., Сандберг Р., Ло С., Хребтукова И., Чжан Л., Майр С. и др. Альтернативная регуляция изоформ в транскриптомах тканей человека. Природа. 2008. 456 (7221): 470–476. pmid: 18978772
12. Lewandowska MA. Недостающий кусочек головоломки: сплайсинговые мутации. Int J Clin Exp Pathol. 2013. 6 (12): 2675–2682. pmid: 24294354
13. Трапани И., Пуппо А., Ауриккио А. Векторные платформы для генной терапии наследственных ретинопатий.Prog Retin Eye Res. 2014; 43С: 108–128.
14. Петрс-Сильва Х., Динкулеску А., Ли К., Мин Ш., Чиодо В., Панг Дж. Дж. И др. Высокоэффективная трансдукция сетчатки мыши тирозин-мутантными векторами серотипа AAV. Mol Ther. 2009. 17 (3): 463–471. pmid: 193
15. Янагихаши С., Накадзава М., Куротаки Дж., Сато М., Миягава Ю., Огуро Х. Аутосомно-доминантная центральная ареолярная хориоидальная дистрофия и новая мутация Arg195Leu в гене периферина / RDS. Arch Ophthalmol.2003. 121 (10): 1458–1461. pmid: 14557183
16. Салливан Л.С., Боун С.Дж., Берч Д.Г., Хьюбэнкс-Уитон Д., Хекенливли Дж. Р., Льюис Р.А. и др. Распространенность болезнетворных мутаций в семьях с аутосомно-доминантным пигментным ретинитом: скрининг известных генов в 200 семьях. Инвестируйте Ophthalmol Vis Sci. 2006. 47 (7): 3052–3064. pmid: 16799052
17. Коко Р.М., Теллерия Дж.Дж., Санабрия М.Р., Родригес-Руа Э., Гарсия МТ. Мутации PRPh3 (Peripherin / RDS), связанные с различными макулярными дистрофиями в испанской популяции: новая мутация.Eur J Ophthalmol. 2010. 20 (4): 724–732. pmid: 20213611
18. Буду, Хаясака С., Мацумото М., Ямада Т., Чжан XY, Хаясака Ю. Мутация гена периферина / RDS (Pro210Leu) и полиморфизмы у японских пациентов с дистрофиями сетчатки. Jpn J Ophthalmol. 2001. 45 (4): 355–358. pmid: 11485765
19. Felbor U, Schilling H, Weber BH. Желточная макулярная дистрофия у взрослых часто связана с мутациями в гене периферина / RDS. Hum Mutat. 1997. 10 (4): 301–309.pmid: 9338584
20. Saga M, Mashima Y, Akeo K, Oguchi Y, Kudoh J, Shimizu N. Новая мутация Cys-214-Ser в гене периферина / RDS в японской семье с аутосомно-доминантным пигментным ретинитом. Hum Genet. 1993. 92 (5): 519–521. pmid: 8244346
21. Пейн А.М., Даунс С.М., Бессант Д.А., Берд А.С., Бхаттачарья СС. Эффект основателя, наблюдаемый в британской популяции, мутации 172 периферина / RDS и дальнейшее уточнение генетического позиционирования гена периферина / RDS.Am J Hum Genet. 1998. 62 (1): 192–195. pmid: 9443872
22. Якобсон С.Г., Сидесиян А.В., Кемп С.М., Шеффилд В.К., Стоун Э.М. Функция фоторецепторов у гетерозигот с инсерционными или делеционными мутациями в гене RDS. Инвестируйте Ophthalmol Vis Sci. 1996. 37 (8): 1662–1674. pmid: 8675410
23. Родригес Дж. А., Ганнон А. М., Дайгер С. П.. Скрининг мутаций в родопсине и периферине / RDS у пациентов с аутосомно-доминантным пигментным ретинитом. Am J Hum Genet. 1994; 55 (Прил.3): 44. http://www.osti.gov/scitech/biblio/134309.
24. Kohl S, Christ-Adler M, Apfelstedt-Sylla E, Kellner U, Eckstein A, Zrenner E, et al. Мутации гена RDS / периферина являются частыми причинами центральных дистрофий сетчатки. J Med Genet. 1997. 34 (8): 620–626. pmid: ⁵¹
25. Реннер А.Б., Фибиг Б.С., Вебер Б.Х., Виссинджер Б., Андреассон С., Гал А. и др. Фенотипическая изменчивость и долгосрочное наблюдение за пациентами с известными и новыми мутациями гена PRPh3 / RDS.Am J Ophthalmol. 2009; 147 (3): 518–530 e511. pmid: 174
26. Акимото М., Ченг Х., Чжу Д., Бжезинский Я.А., Ханна Р., Филиппова Е. и др. Нацеливание GFP на новорожденные палочки с помощью промотора Nrl и профилирование временной экспрессии фоторецепторов с сортировкой по потоку. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103 (10): 3890–3895. pmid: 16505381
27. Fei Y, Hughes TE. Трансгенная экспрессия зеленого флуоресцентного белка медузы в фоторецепторах колбочек мыши. Vis Neurosci.2001. 18 (4): 615–623. pmid: 11829307
28. Бечирович Э., Нгуен О.Н., Папарисос С., Бутц Э.С., Штерн-Шнайдер Г., Вольфрум У. и др. Периферин-2 связывает родопсин с каналом CNG во внешних сегментах палочковых фоторецепторов. Hum Mol Genet. 2014. 23 (22): 5989–5997. pmid: 24963162
29. Stricker HM, Ding XQ, Quiambao A, Fliesler SJ, Naash MI. Мутация Cys214-> Ser в периферине / rds вызывает фенотип потери функции у трансгенных мышей. Biochem J. 2005; 388 (Pt 2): 605–613.pmid: 15656787
30. Nour M, Ding XQ, Stricker H, Fliesler SJ, Naash MI. Модуляция экспрессии периферина / rds у трансгенных мышей: критические уровни и эффект сверхэкспрессии. Инвестируйте Ophthalmol Vis Sci. 2004. 45 (8): 2514–2521. pmid: 15277471
31. Ding XQ, Nour M, Ritter LM, Goldberg AF, Fliesler SJ, Naash MI. Мутация R172W в периферине / rds вызывает дистрофию колбочек у трансгенных мышей. Hum Mol Genet. 2004. 13 (18): 2075–2087. pmid: 15254014
32.Мерфи Д., Сингх Р., Коландайвелу С., Рамамурти В., Стоилов П. Альтернативный сплайсинг формирует фенотип мутации в BBS8, вызывающий несиндромный пигментный ретинит. Mol Cell Biol. 2015; 35 (10): 1860–1870. pmid: 25776555
33. Siegert S, Cabuy E, Scherf BG, Kohler H, Panda S, Le YZ и др. Код транскрипции и карта заболеваний для взрослых типов клеток сетчатки. Nat Neurosci. 2012; 15 (3): 487–495, S481-482. pmid: 22267162
34. Ван И, Сяо Х, Чжан Дж., Чоудхури Р., Робертсон А., Ли К. и др.Сложная сеть факторов с перекрывающимися аффинностями подавляет сплайсинг через интронные элементы. Nat Struct Mol Biol. 2013. 20 (1): 36–45. pmid: 23241926
35. Ван И, Ма М., Сяо X, Ван З. Энхансеры интронного сплайсинга, родственные факторы сплайсинга и контекстно-зависимые правила регулирования. Nat Struct Mol Biol. 2012. 19 (10): 1044–1052. pmid: 22983564
36. Кох С., Сотилингам В., Гарсия Гарридо М., Танимото Н., Бечирович Е., Кох Ф. и др. Генная терапия восстанавливает зрение и задерживает дегенерацию в модели пигментного ретинита у мышей CNGB1 (- / -).Hum Mol Genet. 2012. 21 (20): 4486–4496. pmid: 22802073
37. Михалакис С., Мюльфридель Р., Танимото Н., Кришнамурти В., Кох С., Фишер М. Д. и др. Восстановление зрения колбочек на модели врожденного полного отсутствия функции фоторецепторов колбочек на мышах CNGA3 — / -. Mol Ther. 2010. 18 (12): 2057–2063. pmid: 20628362
38. Михалакис С., Гейгер Х., Хаверкамп С., Хофманн Ф., Герстнер А., Биль М. Нарушение нацеливания опсина и миграции фоторецепторов колбочек в сетчатке мышей, лишенных циклического нуклеотид-управляемого канала CNGA3.Инвестируйте Ophthalmol Vis Sci. 2005. 46 (4): 1516–1524. pmid: 157
39. Huttl S, Michalakis S, Seeliger M, Luo DG, Acar N, Geiger H и др. Нарушение нацеливания на каналы и дегенерация сетчатки у мышей, лишенных циклической нуклеотидной субъединицы канала CNGB1. J Neurosci. 2005. 25 (1): 130–138. pmid: 15634774
40. Much B, Wahl-Schott C, Zong X, Schneider A, Baumann L, Moosmang S и др. Роль субъединичной гетеромеризации и N-связанного гликозилирования в формировании функциональных активированных гиперполяризацией циклических нуклеотид-зависимых каналов.J Biol Chem. 2003. 278 (44): 43781–43786. pmid: 125
Влияние фосфорилирования родопсина на адаптацию к темноте у палочек мышей
Abstract
Родопсин является прототипом рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), который активируется, когда его фрагмент сетчатки 11- цис- фотоизомеризуется до всех транс сетчатка. Этот шаг инициирует каскад реакций, с помощью которых стержни сигнализируют об изменении интенсивности света. Как и другие GPCR, родопсин дезактивируется посредством фосфорилирования рецептора и связывания аррестина.Затем достигается полное восстановление чувствительности рецептора, когда родопсин регенерируется с помощью ряда шагов, которые возвращают рецептор в его основное состояние. Здесь мы показываем, что дефосфорилирование опсиновой части родопсина является чрезвычайно медленным, но необходимым шагом в восстановлении зрительного пигмента до его основного состояния. Мы используем новое наблюдение: изолированные сетчатки мышей, хранящиеся в стандартных средах для обычных физиологических записей, демонстрируют притупленное дефосфорилирование родопсина. Изоэлектрическое фокусирование с последующим вестерн-блот-анализом обесцвеченной изолированной сетчатки показало небольшое дефосфорилирование родопсина в течение до 4 часов в темноте, даже в условиях, когда родопсин полностью регенерировался.Микроспектрофотометрические определения спектров родопсина показывают, что регенерированный фосфо-родопсин имеет такую же молекулярную фоточувствительность, что и нефосфорилированный родопсин, и что мгновенные ответы, измеренные с помощью ретинальной электроретинограммы trans или записи аспирационного электрода одной клетки, показали кинетику, адаптированную к темноте. Единичные квантовые ответы демонстрировали нормальную адаптированную к темноте кинетику, но палочки были только наполовину менее чувствительны, чем палочки, содержащие исключительно нефосфорилированный родопсин. Мы предлагаем модель, в которой освещенная светом сетчатка содержит смешанную популяцию фосфорилированного и нефосфорилированного родопсина.Более того, полная адаптация к темноте может произойти только тогда, когда весь родопсин дефосфорилирован — процесс, который требует> 3 часов в полной темноте.
ЗНАЧИМОЕ ЗАЯВЛЕНИЕ G-белок-сопряженные рецепторы (GPCR) составляют крупнейшее суперсемейство белков, составляющих около 4% генома млекопитающих, члены которого имеют общую мембранную топологию. Передача сигналов с помощью GPCR регулирует широкий спектр физиологических процессов, включая вкус, обоняние, слух, зрение, а также сердечно-сосудистый, эндокринный и репродуктивный гомеостаз.Важной особенностью передачи сигналов GPCR является ее своевременное завершение. Обычно это происходит, когда после активации GPCR быстро фосфорилируются специфическими рецепторными киназами и впоследствии связываются родственными аррестинами. Восстановление чувствительности рецептора к основному состоянию требует дефосфорилирования рецептора и отсоединения аррестина, процессы, которые плохо изучены. Здесь мы исследуем в фоторецепторах палочек мышей взаимосвязь между дефосфорилированием родопсина и восстановлением зрительной чувствительности.
Введение
Ключевой особенностью биологии G-белок-сопряженных рецепторов (GPCR), общей для большинства GPCR, является их фосфорилирование одной из семейства рецепторных киназ и их последующее связывание с аррестином (Carman and Benovic, 1998; Lefkowitz, 2004 ). Эти два последовательных шага приводят к быстрому подавлению активности рецепторов. Эта функция позволяет GPCR обнаруживать и передавать быстрые изменения в окружающей среде. Это важное преимущество для фоторецепторов в виде палочки и колбочки, которые должны обнаруживать мимолетные изображения различной интенсивности, которые быстро проходят через сетчатку.В палочковидных фоторецепторах киназа-1 рецептора G-белка (GRK1) последовательно фосфорилирует кластер из шести-семи остатков серина / треонина, расположенный рядом с С-концом родопсина (Kühn, 1974; Chen et al., 1995; Hurley et al., 1998; Mendez et al., 2000). За этим следует связывание аррестина-1 (Arr1), что приводит к полному прекращению активации рецептора (Wilden et al., 1986). Количество реакций фосфорилирования и связывание аррестина обеспечивает независимые этапы, которые строго контролируют активное время жизни родопсина, что проявляется в высоко воспроизводимых одноквантовых ответах (SQR; Doan et al., 2006; Азеведо и др., 2015). Эта особенность важна для стержней, потому что SQR представляют собой большую часть функционального диапазона стержня.
Для полной регенерации родопсина до состояния адаптации к темноте после воздействия света требуется, чтобы родопсин дефосфорилировался и чтобы Arr1 отделялся от рецептора. Это особенно важно после воздействия яркого света на глаз, при котором сохраняется значительное фосфорилирование шести фосфорилируемых остатков родопсина мыши и человека (Kennedy et al., 2001). Реакция дефосфорилирования родопсина, по-видимому, является медленной ( in vivo, ) (Kennedy et al., 2001; Lee et al., 2010). Более того, регенерированный фосфородопсин, как было установлено, проявляет более низкую каталитическую активность в анализах in vitro (Miller et al., 1986; Wilden et al., 1986; Bennett and Sitaramayya, 1988; Wilden, 1995). Однако эти результаты отражают суммарную активность пула молекул родопсина на усиление трансдукции, но не предоставляют информации о физиологических последствиях присутствия этих фосфорилированных пигментов родопсина, природе световых ответов, которые эти пигменты производят, и их эффекте. для восстановления чувствительности неповрежденной сетчатки.
Почти 40 лет назад Miller et al. (1977) измерили скорость дефосфорилирования опсина в фоторецепторах палочек лягушки после воздействия яркого света. Однако в то время не проводились электрофизиологические измерения, которые позволили бы коррелировать с состоянием адаптации. Наиболее убедительные на сегодняшний день исследования, подтверждающие связь между адаптацией к темноте и состоянием фосфорилирования родопсина, были получены в экспериментах in vivo в на мышах дикого типа (WT) (Kennedy et al., 2001; Lee et al., 2010). Эти исследования коррелировали скорость дефосфорилирования родопсина со скоростью адаптации к темноте, но не продемонстрировали причинную связь между этими процессами. Более того, они продемонстрировали, что значительное количество родопсина фосфорилируется при длительном воздействии света.
Основная цель нашей работы — продемонстрировать взаимосвязь между дефосфорилированием родопсина и адаптацией к темноте в сетчатке мышей. Подавление дефосфорилирования родопсина генетическим путем у мышей проблематично, поскольку ген родопсинфосфатазы окончательно не идентифицирован (Ramulu et al., 2001). В этом исследовании мы определили методологию, с помощью которой дефосфорилирование родопсина снижается до неопределяемого уровня. Мы используем эту методологию для проверки гипотезы о том, что дефосфорилирование родопсина является предпосылкой восстановления чувствительности во время адаптации к темноте. Мы обнаружили, что регенерированный фосфорилированный родопсин можно фотоактивировать для инициации фототрансдукции, но с меньшей эффективностью по сравнению с нефосфорилированной формой. Кроме того, мы демонстрируем, что, когда до 90% родопсина остается фосфорилированным после отбеливания, последующая адаптация к темноте приводит к меньшим квантовым ответам, кинетика которых неотличима от тех, которые возникают в стержнях, содержащих нефосфорилированную форму.Наши результаты, вместе с результатами предыдущих исследований in vivo, (Kennedy et al., 2001; Lee et al., 2010) и in vitro, (Miller et al., 1977), подтверждают, что дефосфорилирование опсина отвечает за новая очень долговечная форма адаптации стержня к темноте, которая влияет на зрение на пороге.
Результаты
Наш подход был разработан для установления взаимосвязи между дефосфорилированием родопсина и адаптацией к темноте. Во-первых, мы использовали IEF в сочетании с вестерн-блоттингом для измерения уровней фосфорилирования родопсина в адаптированных к темноте, обесцвеченных и регенерирующих сетчатках.Одновременно мы коррелировали эти (IEF) данные с восстановлением чувствительности к вспышке, измеренным в изолированной сетчатке с помощью транс, -ретинальной ERG или записи одноклеточного отсасывающего электрода.
Измерение видов фосфорилированного родопсина с помощью IEF
Рисунок 2 A иллюстрирует гели IEF, которые мы использовали для измерения степени фосфорилирования родопсина в изолированной сетчатке от мышей WT перед обесцвечиванием (адаптированная к темноте в течение ночи) и в разное время до 180 °. мин. после воздействия яркого света, в результате которого получился отбеливатель с содержанием родопсина 70%.В течение периода до и после отбеливания каждую сетчатку инкубировали в темноте в забуференной бикарбонатом оксигенированной среде Эймса (в отсутствие ретиналя 11- цис-), поддерживаемой при температуре 35-37 ° C. Степень фосфорилирования родопсина указывается в гелях IEF множеством полос, представляющих различные фосфорилированные виды опсина. Подобно человеческому родопсину, мышиный родопсин имеет три сериновых и три треониновых остатка (al-Ubaidi et al., 1990), которые могут фосфорилироваться после воздействия отбеливающего света (Kennedy et al., 2001; Ли и др., 2010). Например, полоса, обозначенная 1P на фиг. 2 A , представляет собой однократно фосфорилированные виды. Точно так же полоса, обозначенная 4P, соответствует фосфорилированию четырех из шести остатков. Наконец, 6P представляет собой случай, когда все шесть сайтов были фосфорилированы. Из рисунка 2 A видно, что после 3 часов инкубации в темноте наблюдается стойкое и значительное количество фосфорилированного обесцвеченного фотопигмента. Хотя этот метод не дает информации об идентичности конкретных остатков, которые фосфорилируются, результаты показывают, что после того, как каждый остаток фосфорилируется после воздействия света, его состояние фосфорилирования мало изменяется в течение> 3 часов.Отрицательный контроль для оценки фосфорилирования родопсина с помощью IEF после отбеливающего света проиллюстрирован гелем, отображаемым в крайнем правом углу Рисунка 2 A . Этот гель был получен из обесцвеченной сетчатки GRK1 ^{— / —}, в которой родопсинкиназа была генетически удалена. Напротив, на Фигуре 2 B показан аналогичный эксперимент, проведенный на живых мышах WT. Здесь сетчатка была удалена у мышей либо до, либо после воздействия света, который, как было установлено, обесцвечивал ~ 90% родопсина.Сетчатку подвергали быстрой заморозке для анализа IEF и обрабатывали так же, как и для гелей на Фигуре 2 A . После воздействия ~ 90% отбеливателя, как показано на полосе, обозначенной 0 мин на Рисунке 2 B , мы наблюдали (после количественной оценки данных), что ~ 90% опсина фосфорилировалось. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями in vivo на мышах (Ohguro et al., 1995; Mendez et al., 2000; Kennedy et al., 2001; Lee et al., 2010). Однако наши и приведенные выше результаты несовместимы с наблюдениями незначительного фосфорилирования родопсина из сетчатки земноводных (Binder et al., 1996). Причина этой разницы, вероятно, связана с более низким уровнем отбеливания по сравнению с нашими условиями. В наших данных, представленных на рисунке 2 B , мы наблюдали, что дефосфорилирование родопсина было почти полным после 3 часов адаптации к темноте. Эти данные ясно показывают, что через 120 минут после отбеливания ни один из опсинов не связал с ними более двух фосфатов. Из сравнения гелей на фиг. 2, A и B очевидно, что профили дефосфорилирования сильно различаются.У живых мышей дефосфорилирование опсина происходит за время ~ 3 ч, как было показано ранее (Kennedy et al., 2001; Lee et al., 2010). Однако в изолированных сетчатках уровни фосфорилирования по всем остаткам не снизились заметно по сравнению с их начальными уровнями после отбеливания в любое время.
Рисунок 2.
Дефосфорилирование опсина, измеренное с помощью гелей IEF, до и после in vivo и ex vivo обесцвечивания сетчатки мыши. Отбеливание in vivo выполняли путем прямого проецирования света 500 нм в глаза анестезированных мышей.Обесцвечивание Ex vivo проводили путем проецирования света на сетчатку, которая была изолирована от РПЭ и помещена в раствор Эймса в небольшой пластиковой чашке Петри. Гели IEF демонстрируют сегрегацию родопсина на основе общего количества прикрепленных фосфатов, как указано в правой части каждой серии гелей. A , Гели из изолированной сетчатки мышей WT. Сетчатку от адаптированных к темноте мышей либо хранили в темноте, либо отбеливали на 70% и инкубировали в темноте в течение указанного времени без добавления сетчатки 11- цис- перед замораживанием и обработкой.Единственная дорожка справа была обработана из обесцвеченной сетчатки мыши Grk1 ^{— / —}. B , Гели сетчатки живых животных, обработанные как в A . Мыши были либо адаптированы к темноте, либо их сетчатка подвергалась 90% -ному отбеливанию in vivo . После отбеливания животных оставляли в темноте на различные периоды (как указано на панели). C , Гели из изолированных сетчаток мышей GNAT2 ^{— / —}.Сетчатку от адаптированных к темноте мышей либо хранили в темноте, либо обесцвечивали на 50% и инкубировали с добавленным сетчаткой 11- цис- в течение указанного времени в темноте. D , Графики из гелей ИЭФ, полученных из изолированных препаратов сетчатки мышей GNAT2 ^{— / —} в четырех различных условиях (слева направо): 50% отбеленных ( n = 3), 50% отбеленных и инкубировали в темноте с 10 мкм сетчаткой 11- цис- в течение 100 минут ( n = 4), в течение 160 минут ( n = 7) и 220 минут ( n = 6).Интенсивности полос гелей IEF были количественно определены и проанализированы с использованием NIH ImageJ. По оси абсцисс отложено фракционное фосфорилирование опсина. Участки (остатки) с нулевым или множественным количеством фосфатов отложены по оси ординат. Планки погрешностей составляют ± SD. E , Графики, как в D , полученные из сетчатки живых животных WT в пяти различных условиях (слева направо): отбеленные (90%), а затем умерщвленные через 0 минут в темноте ( n = 4 ), обесцвеченный и убитый через 30 минут в темноте ( n = 4), обесцвеченный и убитый через 60 минут в темноте ( n = 4), обесцвеченный и убитый через 120 минут в темноте ( n = 4), или обесцвеченный и убитый через 180 минут в темноте ( n = 4). F , График фракционного фосфорилирования опсина в зависимости от времени после обесцвечивания в изолированных сетчатках (черные квадраты) или в обесцвеченных сетчатках in vivo (красные треугольники). Точки данных были рассчитаны из D и E . Для каждой дорожки плотности от полос 1P до 6P были суммированы и разделены на суммарные плотности от всех полос (от 0 до 6P), чтобы получить долю фосфорилированного родопсина в этом образце. Планки погрешностей ± SD.Красная линия (P _до = -0,004 t + 0,91) аппроксимирована треугольниками методом наименьших квадратов. Черная линия — горизонтальная со значением 0,5.
Поскольку наши исследования были разработаны для сравнения уровней фосфорилирования родопсина после отбеливания с измерениями восстановления чувствительности стержней, сделанными всей ERG сетчатки, было важно определить скорость дефосфорилирования в модели мышей, в которой только стержневой компонент электрического ответ присутствует. Модель мыши GNAT2 ^{— / —} удовлетворяет этому требованию, потому что компонент конуса ERG отсутствует, и ответы стержня могут быть измерены без усложнения ответов колбочек.Рисунок 2 C показывает, что, подобно сетчатке дикого типа, очень небольшое дефосфорилирование опсина наблюдалось в изолированной сетчатке GNAT2 ^{— / —} в течение до 4 часов инкубации в темноте после 50% отбеливания и, кроме того, после полного регенерация пигмента сетчаткой 11- цис-. Действительно, если судить по полосе 0P (нефосфорилированный родопсин), количество небеленого и нефосфорилированного пигмента остается на уровне 50% даже через 220 минут. Это согласуется с нашими измерениями количества обесцвеченного родопсина.Графики на Фигуре 2, D и E , показывают усредненные данные фосфорилирования из изолированных GNAT2 ^{— / —} сетчатки (как показано на Фиг.2 C ) и сетчатки мышей WT, обесцвеченных in vivo. (как показано на рис.2 B ). Эти данные графически иллюстрируют, что профили фосфорилирования, наблюдаемые в сетчатке мышей WT, интактных или изолированных, также наблюдаются в штамме GNAT2 ^{— / —}. Каждый график на фиг. 2, D и E , отображает в разное время долю всех фосфорилированных остатков на опсине.В таблице 1 сравниваются результаты, аналогичные показанным на рисунке 2, полученные с 20, 50 и 70% отбеливателей, показывая, что устойчивое фосфорилирование наблюдается на остатках в широком диапазоне фракций отбеливателя. Здесь также очевидно, что распределение фосфорилирования среди 1P – 6P, по-видимому, не зависит от обесцвеченной фракции. Рисунок 2 F отображает эти данные как долю фосфорилированных видов (суммарные сигналы от 1P до 6P, деленные на общую популяцию родопсина) как функцию времени после отбеливания, для изолированных сетчаток (черные квадраты) и у интактного животного (красные треугольники). .Сплошная красная прямая линия, соединенная с красными треугольниками, иллюстрирует временной ход дефосфорилирования, измеренный в сетчатке интактных мышей. Линейное снижение указывает на то, что механизм дефосфорилирования может быть насыщенным. Черная горизонтальная линия, проведенная через закрашенные квадраты, показывает, что уровень фосфорилирования остается практически неизменным в изолированной сетчатке после отбеливания в течение до 220 мин на уровне, соответствующем обесцвеченной фракции. Для этих данных был проведен линейный регрессионный анализ (данные не показаны).Линия линейной регрессии существенно не отклонялась от графика ( p = 0,2484). Эти данные ясно показывают, что не происходит значительного дефосфорилирования родопсина в изолированной сетчатке после обесцвечивания, тогда как эффективное дефосфорилирование имеет место in vivo . Кроме того, блокирование дефосфорилирования в отсутствие (фиг. 2 A ) или присутствие (фиг. 2 C ) сетчатки 11- цис- указывает на то, что регенерация пигмента не влияет на дефосфорилирование родопсина в изолированной сетчатке.Вместе данные экспериментов IEF демонстрируют, что изоляция сетчатки от живых животных блокирует практически все дефосфорилирование опсина по сравнению с дефосфорилированием, которое обычно происходит in vivo .
Таблица 1.
Фосфорилирование родопсина в обесцвеченной изолированной сетчатке
Это новое открытие является надежным. Подобные результаты были получены в различных экспериментальных условиях, обычно используемых в физиологических исследованиях изолированной сетчатки, как показано на рисунке 3.К ним относятся различные буферы для суперфузии / инкубации, в которых pH регулируется с помощью HEPES или бикарбоната в диапазоне pH от 5,6 до 8,0, в присутствии и в отсутствие сетчатки 11- цис- (рис. 3 A ), при различных условиях. интенсивности отбеливающего света (рис. 3 B ), когда сетчатка была неповрежденной или порезанной (рис. 3 C ), в условиях непрерывной суперфузии или статической инкубации, с прикрепленным РПЭ или без него (рис. 3 D ) ), с экзогенным межфоторецепторным ретиноид-связывающим белком или без него (данные не показаны), различной степени обесцвечивания (от 20 до 70%; таблица 1), а также в генетических моделях WT и GNAT2 ^{— / —} (рис.2).
Рисунок 3.
Дефосфорилирование опсина в изолированной сетчатке, измеренное с помощью гелей IEF в различных условиях. Гели демонстрируют сегрегацию родопсина на основе общего количества прикрепленных фосфатов, как указано в правой части каждой серии гелей. Если не указано иное, сетчатку инкубировали в среде Эймса с бикарбонатным буфером при 95% O ₂/5% CO ₂. A , гели IEF, измеренные после инкубации в различных условиях, как указано на панели.Сетчатку либо адаптировали к темноте (крайняя левая полоса), либо обесцвечивали на 70% и инкубировали в среде Эймса в темноте в течение 180 мин. В этих гелях иногда наблюдается полоса опсина, представляющая апопротеин, связанный с неполной регенерацией сетчатки 11- цис-. B , гели IEF сетчатки, которые были обесцвечены на 70% при различных скоростях обесцвечивания (как указано на панели) и инкубированы в среде Эймса в темноте в течение 180 мин. C , гели IEF сетчатки, которые были обесцвечены на 50 или 70%, измельчены и затем инкубированы в среде Эймса, содержащей 11- цис- сетчатки, в темноте в течение 180 мин. D , Наглазники, содержащие как нервную сетчатку, так и RPE, отбеливали и инкубировали в темноте, как в C . E , Retinae инкубировали в среде Эймса, содержащей 4 мМ Na 1-лактата, обесцвеченной на 70%, и немедленно замораживали (0 мин) или замораживали после инкубирования в темноте в течение 60 или 180 мин. Для каждой дорожки сигналы от 1P до 6P были суммированы и разделены на сигналы от всех полос (от 0 до 6P), чтобы получить долю фосфорилированного родопсина в этом образце.Значение, полученное для 0 минут, составило 0,72 ± 0,04 ( n = 8), что хорошо соответствует расчетным 70% отбеливателям, и 0,71 ± 0,07 (60 минут, n = 4) и 0,44 ± 0,06 (180 минут, ). n = 4). Эти значения были подвергнуты одностороннему дисперсионному анализу. Значение p для одностороннего дисперсионного анализа было 1,7 × 10 ^-6, а значение p для HSD Тьюки было p <0,002 как для 180 по сравнению с 0 мин, так и для 180 по сравнению с 60 мин. F , Retinae инкубировали со средой Эймса (без добавления лактата) при 20% O ₂/5% CO ₂/75% N ₂ и подвергали отбеливанию и инкубации в темноте, как описано в Е .Фракции фосфорилированного родопсина составляли 0,72 ± 0,04 (0 мин, n = 8) и 0,73 ± 0,02 ( n = 4) в течение 60 минут и 0,64 ± 0,05 ( n = 4) в течение 180 минут. Односторонний дисперсионный анализ показал значение p , равное 0,0049. За этим последовал тест HSD Тьюки, который показал значительную разницу между 180 и 0 мин и 180 против 60 мин ( p <0,01 для обоих сравнений).
Мы обнаружили два условия, которые способствуют дефосфорилированию родопсина в изолированной сетчатке.Оба они связаны с метаболическим состоянием сетчатки. Обычной практикой является проведение электрофизиологических экспериментов на сетчатке млекопитающих в условиях высокого напряжения кислорода. Условия наших экспериментов соответствовали этой норме, используя 95% O ₂/5% CO ₂. Однако в ряде исследований установлено, что натяжение O ₂ в области фоторецепторов намного ниже в интактной сетчатке млекопитающих и составляет от 10 до 30% (Cringle et al., 2002; Yu and Cringle, 2006; Birol et al., 2007; Лау и Линсенмайер, 2012). Кроме того, фоторецепторные клетки сетчатки млекопитающих используют аэробный гликолиз из-за их высокой метаболической потребности (Adler and Southwick, 1992; Hurley et al., 2015). Это приводит к высокому уровню лактата в матрице интерфоторецепторов. Этот лактат поглощается и используется в качестве топлива клетками Мюллера (Lindsay et al., 2014; Hurley et al., 2015). Поэтому некоторые из наших экспериментов проводились в присутствии 4,0 мМ 1-лактата Na, добавленного в среду Эймса (рис. 3 E ).Другие эксперименты проводились при уровне O ₂, аналогичном тому, который был предложен как физиологический в упомянутой выше работе (20% O ₂/5% CO ₂/75% N ₂; Рис. 3 F. ). Эти эксперименты были разработаны, чтобы проверить, может ли дефосфорилирование усиливаться в этих более физиологических условиях. При добавлении в среду 4 мМ 1-лактата наблюдалось выраженное влияние на дефосфорилирование родопсина (рис. 3 E ). Интересно, что мы обнаружили умеренное, но статистически значимое усиление дефосфорилирования родопсина, когда сетчатка подвергалась воздействию 20% O ₂ (рис.3 F ). Результаты этих экспериментов предполагают участие метаболических процессов в дефосфорилировании родопсина. Молекулярный механизм (ы) ингибирования дефосфорилирования, который мы наблюдали в изолированной сетчатке, в дальнейшем не исследовался, но оставлен для дальнейшего изучения. Однако мы обнаружили, что блокирование дефосфорилирования родопсина в изолированной сетчатке является полезным инструментом для определения механизмов адаптации к темноте.
Микроспектрофотометрическое измерение фосфорилированного родопсина
Чтобы определить, влияет ли фосфорилированный опсин на регенерацию пигмента, мы выполнили регистрацию MSP содержания зрительного пигмента в наружных сегментах палочек мыши в интактной сетчатке, изолированной и обработанной в тех же условиях, что и для анализа IEF.Рис. 4 A отображает спектры поглощения, полученные от группы внешних сегментов палочек, расположенных вдоль срезанного края куска изолированной сетчатки, которая была обесцвечена на величину, равную 50%, после инкубации в темноте в течение 3 часов в инкубационной камере. , а затем перешли на стадию MSP. Спектр 1 измеряли после суперфузии в темноте и переноса на стадию MSP. После этого на сетчатку был введен раствор, содержащий 10 мкм 11- цис- сетчатки. Спектр 2 показывает, что в течение этого промежуточного периода регенерировалось значительное количество родопсина.Спектр 3 был получен после воздействия яркого света, рассчитанного на обесцвечивание> 99% визуального пигмента. Пиковое поглощение спектра 1 соответствует 50% отбеливателю (см. Материалы и методы). Спектр 3 соответствует отбеливанию> 99% родопсина в конце эксперимента. Наблюдение за тем, что спектр 2 имеет вдвое большую оптическую плотность, чем спектр 1, подтверждает, что зрительный пигмент полностью регенерировался. Эксперимент, проиллюстрированный на фиг. 4 B , был проведен, чтобы продемонстрировать, что инкубация в течение длительных периодов до 3 часов в светонепроницаемом инкубационном контейнере не нарушает физиологическое состояние изолированной сетчатки, что ухудшает регенерацию родопсина.Спектр 4 был измерен через 3 часа после того, как сетчатка была обесцвечена на 50%, а затем помещена в светонепроницаемый инкубационный контейнер в растворе Эймса, содержащем 11- цис- сетчатки. Пиковое поглощение на этом графике, уровень которого аналогичен измеренному в сетчатке, адаптированной к темноте, предполагает, что большая часть обесцвеченного родопсина была регенерирована в течение этого 3-часового периода инкубации. Чтобы подтвердить это, сетчатка была обработана дополнительным количеством сетчатки 11- цис- на этапе MSP, давая черный след (рис. 4 B , 5), который не показывает дополнительного увеличения поглощения.Затем определяли общее количество родопсина во внешних сегментах путем вычисления разницы в пиковом поглощении между этим измерением и спектром 6, полученным после отбеливания> 99%. Таким образом, эксперименты на рисунке 4 показывают, что мы смогли отбелить сетчатку с высокой точностью, а затем полностью регенерировать зрительный пигмент, инкубируя сетчатку в растворе, содержащем 11- цис- сетчатки, независимо от того, проводилось ли это в светонепроницаемой среде. инкубационный контейнер или на стадии МСП.Кроме того, эти спектрофотометрические данные вместе с данными IEF, показанными на фиг. 2, демонстрируют, что дефосфорилирование не требуется для регенерации пигмента. Это наблюдение согласуется с недавним отчетом об использовании фоторецепторов карпа (Yamaoka et al., 2015). Примечательно, что спектр фосфорилированного родопсина очень похож на спектр нативного родопсина. На это указывает сравнение кривых MSP на рисунке 4, A и B , с голубой сплошной кривой, рассчитанной для идеального раствора родопсина (Govardovskii et al., 2000).
Рис. 4. Спектры поглощения
MSP обесцвеченной и регенерированной сетчатки WT (C57BL / 6). A , Спектр поглощения сетчатки, которая была обесцвечена на 50% (кривая 1, синий цвет), затем обработана сетчаткой 11- цис- на этапе MSP в течение 40 минут (кривая 2, черная), и, наконец, после тщательного отбеливания (след 3, розовый). Голубой след представляет собой нормализованный шаблон родопсина (Говардовский и др., 2000), рассчитанный при λ _max = 503 нм, OD _α = 0.47. B , кривая 4 (зеленый) показывает спектр поглощения сетчатки, которая была обесцвечена на 50% и инкубирована в течение 3 часов с сетчаткой 10 мкм 11- цис- в темноте в светонепроницаемом инкубационном контейнере. . Кривая 5 (черная) показывает спектр поглощения того же препарата после 40 мин дополнительной выдержки в растворе, содержащем 10 мкм 11- цис- сетчатки на стадии MSP. Кривая 6 (розовый) показывает спектр поглощения после тщательного отбеливания (> 99%). Голубой след представляет собой подобранный шаблон родопсина (λ _макс = 503 нм, OD _α = 0.50).
В дополнение к спектральным измерениям фосфорилированного родопсина мы также сравнили молекулярную фоточувствительность родопсина в наружных сегментах стержней, содержащих 100% нефосфорилированный родопсин и 90% P-родопсин с MSP. Это было сделано путем экспонирования сетчатки светом с интенсивностью I в разное время, t . Затем фракционное обесцвечивание пигмента F после каждого экспонирования измеряли микроспектрофотометрически. Светочувствительность P рассчитывалась по уравнению 1.Мы измерили фоточувствительность (6,0 ± 1,3) × 10 ⁻⁹ мкм ² для сетчатки, адаптированной к темноте, содержащей 100% нефосфорилированный родопсин, и (6,7 ± 1,2) × 10 ⁻⁹ мкм ² для сетчатки, содержащей 90% П-родопсин. Эти значения были статистически неотличимы друг от друга ( t тест, t = 0,73, p = 0,49) и очень похожи на светочувствительность, о которой ранее сообщалось для родопсина 5,7 × 10 ^-9 мкм ² (Woodruff et al., 2004; Nymark et al., 2012).
ЭРГ всей сетчатки, измерение чувствительности к вспышке и кинетики реакции во время адаптации к темноте
Затем мы определили, как влияет на адаптацию к темноте, когда дефосфорилирование родопсина ингибируется. Здесь мы использовали запись ERG всей сетчатки GNAT2 ^{— / —} сетчатки. Эти записи были получены из изолированной сетчатки в присутствии AP-4, чтобы блокировать синаптическую передачу от стержневой биполярной клетки к стержневой, а также Ba ²⁺, чтобы блокировать активность клеток Мюллера (см. Материалы и методы).Таким образом, штамм GNAT2 позволяет оценить чувствительность к вспышке всей популяции стержней в условиях, идентичных тем, в которых проводились эксперименты IEF и MSP. Рисунок 5 A (слева направо) показывает семейства ответов от транс -ретинальных ERG, измеренных в условиях адаптации к темноте (рис. 5 A , слева), через 60 минут после 50% -ного отбеливания и инкубации в растворе Эймса ( Рис.5 A , посередине) и после 3-часовой инкубации в растворе Эймса, содержащем 11- цис- сетчатки (рис.5 А , справа). Эти измерения были сделаны на подмножестве сетчатки, которые впоследствии были обработаны для анализа IEF, результаты которого показаны на Рисунке 2 C . Ответы в семье, показанные на средней панели, ускорены по сравнению с ответами, адаптированными к темноте (рис. 5 B , вставка), и демонстрируют меньшие пиковые амплитуды, соответствующие постоянной адаптации опсина (Cornwall et al., 1990; Cornwall and Fain). , 1994). После инкубации в течение 3 часов с сетчаткой 11- цис- в темноте семьи продемонстрировали практически полный возврат к кинетике, адаптированной к темноте, хотя общая амплитуда ответа была несколько меньше.Отношения среднего ответа / интенсивности, измеренные для сетчатки, обработанной таким образом, показаны на Фигуре 5 B . Здесь мы построили график средней амплитуды ответа как функции интенсивности вспышки для сетчатки, адаптированной к темноте (кружки), обесцвеченной на 50% (треугольники), обесцвеченной на 50% и инкубированной в сетчатке 11- цис- в течение 3 часов (квадраты). К данным подбираются функции экспоненциального насыщения (подробности см. В легенде рисунка). В среднем после обесцвечивания мы наблюдали сдвиг функции ответ / интенсивность в сторону более высокой интенсивности (∼1.3 log единицы) по сравнению с условиями до отбеливания, и амплитуда отклика уменьшилась примерно вдвое. В течение 3 часов инкубации в растворе сетчатки 11- цис- амплитуда и чувствительность ответа неуклонно увеличивались до тех пор, пока через 3 часа амплитуда и чувствительность ответа не были почти полностью восстановлены, а кинетика ответа неотличимо отличалась от адаптированной к темноте. Это также проиллюстрировано на вставке к Фигуре 5 B , на которой средние адаптированные к темноте отклики на тусклые вспышки (черный график, время до пика 158 мс) сравниваются с измеренными примерно через 60 минут после 50% отбеливания (розовый график, время до пика 72 мс) и следующие 3 часа инкубации в растворе сетчатки 11- цис- (синий график, время до пика 166 мс).Это восстановление чувствительности и возвращение к кинетике адаптированной к темноте реакции в обесцвеченных и регенерированных изолированных сетчатках предполагает, что, помимо блокирования дефосфорилирования родопсина, физиология палочек существенно не изменяется в условиях наших экспериментов.
Рисунок 5.
Trans -ретинальные ERG, демонстрирующие восстановление чувствительности к вспышке у стержней мышей GNAT2 ^{— / —}, имеющих стойкое фосфорилирование родопсина. A , Семейство ответов изолированных a-волн от адаптированной к темноте сетчатки (слева), от сетчатки, которая была обесцвечена на 50% и инкубирована в темноте в течение 60 минут (в центре), и от сетчатки, которая была обесцвечена ( 50%) и инкубировали в темноте в течение 180 мин в сетчатке 10 мкм 11- цис- (справа). B , Отношения интенсивности и отклика, которые отображают максимальную амплитуду a-волны в зависимости от времени при вышеуказанных условиях. Каждому соотношению соответствует экспоненциальная функция насыщения: В = В _max (1 — exp (- I / τ)), где В, — амплитуда напряжения, В _max — это максимальное значение. амплитуда напряжения насыщенного отклика, I — интенсивность света, а τ — параметр подгонки чувствительности. Данные были записаны для сетчатки, адаптированной к темноте (черные круги, n = 8, V _max = 324 мкВ, τ = 94 hν мкм ^-2), 50% обесцвеченных сетчаток (розовые треугольники, n ). = 6, В _max = 144 мкВ, τ = 1860 hν мкм ^-2), и сетчатка, которая была обесцвечена на 50% и инкубирована в течение 3 часов (синие квадраты, n = 7, V _max = 297 мкВ, τ = 102 hν мкм ^-2).Запись производилась при температуре 35–37 ° C. Планки погрешностей ± SEM. На вставке показаны нормализованные тусклые вспышки от адаптированной к темноте сетчатки (черный след), обесцвеченной на 50% сетчатки (розовый след) и сетчатки, которая была обесцвечена на 50% и инкубирована с сетчаткой 11- cis- 10 мкм в темнота в течение 3 ч (синий след). C , Вестерн-блоты, показывающие транслокацию трансдуцина. Сетчатку либо адаптировали к темноте, либо обесцвечивали на 90%, а затем инкубировали в среде Эймса, содержащей 11- цис- сетчатки, в темноте, как указано над полосами.Сетчатку замораживали, а АФК выделяли из оставшейся сетчатки. Антитела использовали для визуализации количества стержневого трансдуцина (Gtα) во внешнем сегменте. Gβ5L использовали в качестве контроля загрузки. Gβ5S служит для контроля качества загрязняющих веществ. Образец гомогената цельного сетчатки использовали в качестве контроля. Интенсивность сигналов определяли количественно с использованием программного обеспечения NIH ImageJ, и значения для Gtα были нормализованы по отношению к Gβ5L. Нормализованные значения для Gtα по сравнению со значением, адаптированным к темноте (установлено на 1.0) в течение 30 минут составляло 0,6 ± 0,1, а в течение 240 минут — 0,9 ± 0,2 (среднее ± стандартное отклонение, n = 3).
Свет стимулирует фосфорилирование родопсина и транслокацию трансдуцина из внешнего сегмента во внутренние компартменты (Whelan, McGinnis, 1988; Sokolov et al., 2002). Помимо фосфорилирования родопсина, также известно, что местное истощение концентрации трансдуцина снижает активность родопсина (Sokolov et al., 2002; Mao et al., 2013). Однако для наблюдения изменения чувствительности требуется более чем двукратное снижение, поскольку у мышей, гетерозиготных по палочковому трансдуктину, GNAT1 ^+/- (Calvert et al., 2000). Напротив, Arr1 движется в противоположном направлении в ответ на свет (Whelan and McGinnis, 1988; Nair et al., 2005; Strissel et al., 2006), хотя увеличение концентрации Arr1, по-видимому, не влияет на усиление трансдукции (Song и др., 2011). Чтобы определить количество трансдуцина во внешнем сегменте в наших экспериментальных условиях, мы изолировали внешние сегменты сетчатки в темноте или после 90% отбеливания с последующим восстановлением сетчатки 11- цис-. Определения проводили через 30, 180 или 240 мин инкубации в темноте с помощью вестерн-блоттинга для визуализации количества стержневого трансдуцина α (Gtα) во внешнем сегменте.Gβ5L (Keresztes et al., 2004), компонент комплекса трансдуцина GAP, прикреплен к компартменту внешнего сегмента с помощью R9AP (Cao et al., 2010) и использовался в качестве контроля нагрузки (Moaven et al., 2013) . Напротив, Gβ5S представляет собой изоформу, полученную в результате альтернативного сплайсинга того же гена. Он присутствует в компартментах внутреннего сегмента и внутренних нейронах сетчатки и служит для контроля качества загрязняющих веществ (Watson et al., 1996). В наших экспериментальных условиях световое воздействие вызывало снижение уровня α-субъединицы GNAT1 (Gtα) и повышение Arr1 во внешнем сегменте (рис.5 C ), как и в предыдущих отчетах. Количественная оценка сигналов от Gtα, нормализованных к сигналу Gβ5L, показывает, что количество Gtα вернулось во внешний сегмент, аналогично адаптированному к темноте уровню на 180 мин (0,9 ± 0,2, среднее ± стандартное отклонение, n = 4; в котором значение, адаптированное к темноте, составляет 1,0) и впоследствии сохраняется на этом уровне. Мы пришли к выводу, что различия в чувствительности, обнаруженные в стационарных экспериментальных условиях, которые мы использовали в экспериментах с ERG всей сетчатки, описанных выше, и одноклеточные измерения чувствительности (см. Ниже) могут быть отнесены к фосфорилированию родопсина, но не к концентрации трансдуцина во внешнем сегменте.
Одноклеточные измерения чувствительности и кинетики мгновенного ответа
Из данных ERG, представленных на рисунке 5, очевидно, что сетчатка, которая подверглась 50% отбеливанию и последующей регенерации родопсина, содержит половину общего количества родопсина в фосфорилированном состоянии. Чтобы узнать больше о состоянии чувствительности и кинетики ответа в условиях постоянного фосфорилирования, мы провели эксперименты с аспирационным электродом с одной ячейкой. На рис. 6 A показаны семейства откликов от таких текущих записей импульсных ответов стержня в разных ячейках в четырех различных условиях.Слева направо они включают следующее: (1) адаптированный к темноте; (2) обесцвечивают на 50% и инкубируют> 90 мин в темноте; (3) обесцвечивают на 50% и инкубируют в темноте с экзогенным ретиналем 11- цис- в течение 4 часов; и (4) обесцвечивают на 90% и инкубируют в темноте с сетчаткой 11- цис- в течение 4 часов. Мы не смогли наблюдать каких-либо значительных различий во времени адаптированных к темноте мгновенных ответов, измеренных до отбеливания, по сравнению с теми, которые были измерены после отбеливания на 50 или 90% с последующей инкубацией с сетчаткой 11- цис- (рис.7). На рис. 6 B представлены графики функций среднего отклика / интенсивности, измеренные в различных условиях на рис. 6 A . Отношение ответ / интенсивность палочек, адаптированных к темноте (0% P-родопсина), представлено черными кружками, а отношение палочек, адаптированных к отбеливателю, в устойчивом состоянии после 50% отбеливания (нет обработки сетчатки 11- цис-). представленные розовыми треугольниками, палочки, которые были обесцвечены на 50% и инкубированы в течение 4 часов с сетчаткой 11- цис- (50% P-родопсин), представлены синими квадратами, а стержни, которые были обесцвечены на 90%. и инкубировали в течение 4 ч с сетчаткой 11- цис- (90% P-родопсин), представлены оранжевыми ромбами.В каждом случае данные были подогнаны экспоненциальными функциями насыщения, как на рисунке 5 (подробности см. В легенде). Очевидно, что величина темнового тока примерно одинакова после отбеливания и регенерации во всех трех состояниях, независимо от степени фосфорилирования родопсина. Таким образом, нет доказательств стационарной активации трансдуцина фосфорилированным родопсином, как в случае, когда избыток свободного опсина присутствует в условиях, адаптированных к отбеливателю (Cornwall and Fain, 1994).Более того, хотя кривая интенсивности и чувствительность к вспышке в состоянии 50% P-родопсина (S _50% = 0,33 ± 0,04 пА / чв) неотличимы от состояния, адаптированного к темноте 0% P-родопсина (S _DA = 0,33 ± 0,03 пА / hv), небольшой, но значительный сдвиг (менее чувствительный) можно обнаружить в стержнях 90% P-родопсина (S _90% = 0,24 ± 0,05 pA / hv). Этот сдвиг представляет собой среднюю десенсибилизацию ~ 33%.
Рис. 6.
Записи отсасывающего электрода, демонстрирующие восстановление чувствительности к вспышке у обесцвеченных палочек мышей со стойким фосфорилированием родопсина. A , Семейства ответов от адаптированной к темноте палочки (слева), от палочки, обесцвеченной на 50%, инкубированной в темноте в течение 90 мин (в центре слева), от палочки, которая была обесцвечена на 50% и инкубирована с 10 мкм 11- цис- сетчатка в темноте в течение 3 часов (в центре справа) и из стержня, который был обесцвечен на 90% и инкубирован с 10 мкм сетчаткой 11- цис- в темноте в течение 3 часов (справа). B , отношения средней реакции и интенсивности, зарегистрированные для адаптированных к темноте палочек (черные кружки, n = 8), палочек, которые были обесцвечены на 50% и инкубированы в темноте в течение 90 мин (розовые треугольники, n = 4), палочки, которые были обесцвечены на 50% и инкубированы с 10 мкм сетчатки 11- цис- в темноте в течение 3 часов (50% P-родопсин, синие квадраты, n = 10), и палочки, которые были отбелены. 90% и инкубировали с 10 мкМ 11- цис- сетчатки в темноте в течение 3 ч (90% P-родопсин, оранжевые ромбы, n = 10).Функции экспоненциального насыщения: i = i _max (1 — exp (- I / τ)) подгоняются к данным, где i — пиковый фототок, i _max — пик фототок насыщающей вспышки, I — интенсивность, а τ — параметр подгонки чувствительности. Адаптированный к темноте, черная линия, i _max = 12,9 ± 0,7 пА, τ = 73,8 ± 12,6 hν мкм ⁻²; 50% P-родопсин, синяя линия, i _макс = 13.8 ± 0,7 пА, τ = 81,5 ± 13,1 hν мкм ^-2; 90% P-родопсин, оранжевая линия, i _max = 12,8 ± 0,8 пА, τ = 111,0 ± 22,7 hν мкм ^-2. Запись производилась при температуре 35–37 ° C. Планки погрешностей ± SEM.
Рис. 7.
SQR, зарегистрированные для стержней WT, содержащих родопсин (вверху), 50% фосфорилированного родопсина (в центре) и 90% фосфорилированного родопсина (внизу). Красные кривые показывают репрезентативные SQR, которые показаны на рисунке 8. Вставки, средняя форма сигнала всех SQR, представленных на каждой панели ± SEM.Все записи производились при температуре 35–37 ° C.
SQR, возникающих в результате световой активации фосфорилированного родопсина
Для дальнейшего изучения механизма десенсибилизации, вызванной стойким фосфорилированием родопсина после сильных отбеливаний, мы записали ответы на большое количество тусклых вспышек и рассчитали SQR (см. Материалы и методы) . На рисунке 7 показаны наложенные SQR, записанные для палочек, адаптированных к темноте (верхний ряд), палочек, содержащих 50% P-родопсина (средний ряд), и палочек, содержащих 90% P-родопсина (нижний ряд).На вставках к панелям показаны средние кривые ± SEM записанных SQR. Из кривых на фиг. 7 и средних данных, представленных в таблице 2, очевидно, что амплитуды SQR в стержнях, содержащих P-родопсин, меньше, чем у адаптированных к темноте стержней, содержащих исключительно нефосфорилированный родопсин. Более того, усредненные данные, представленные в таблице 2, демонстрируют, что кинетика отклика SQR во всех трех условиях аналогична. Эти данные показывают, что, хотя наблюдается значительное снижение амплитуды SQR, вызванное фосфорилированием родопсина, доли падающих фотонов, которые приводят к ответу в каждом случае, статистически неразличимы.То же верно и для кинетики отклика. Среднее время до пика, а также постоянная времени дезактивации ответа, τ _rec, статистически неразличимы в клетках, содержащих 0, 50 или 90% P-родопсина. Кроме того, мы рассчитали константу активации, A , усредненных SQR, подгоняя уравнение 5 (см. Материалы и методы), модель активации фототрансдукции (Pugh and Lamb, 1993). Мы получили значения активации для различных обработок A _0% P-родопсин = 4.1 с ^-2, A _50% P-родопсин = 3,3 с ^-2 и A _90% P-родопсин = 2,9 с ^-2 (рис.8 A , врезка). Этот расчет демонстрирует более низкий уровень активации фототрансдукции фотоактивированным фосфорилированным родопсином по сравнению с нефосфорилированным родопсином.
Таблица 2. Свойства
SQR из записей отсасывающих клеток одиночных палочек мыши
Рисунок 8.
Среднее SQR, записанное для палочек WT, содержащих родопсин и фосфорилированный родопсин. A , Типичные SQR стержня, содержащего родопсин (черный), 50% фосфорилированный родопсин (синий) и 90% фосфорилированный родопсин (оранжевый). Вставка: усредненные, сглаженные и нормализованные SQR, соответствующие модели активации (Pugh and Lamb, 1993). Подробнее см. В тексте. B , нормализованные SQR из A . Также показана нормализованная средняя тусклая реакция на вспышку от 50% обесцвеченного стержня (розовый). Запись производилась при температуре 35–37 ° C.
Чтобы облегчить сравнение форм сигналов в трех условиях, мы выбрали по одной репрезентативной записи для каждого условия для дополнительного анализа. Эти записи обозначены красными линиями в соответствующих строках на Рисунке 7. Различия в амплитудах SQR показаны на Рисунке 8, A, , с репрезентативными SQR для каждого условия, нанесенными вместе. Здесь ясно, что амплитуда SQR уменьшается, когда родопсин фосфорилируется перед активацией. Эти кривые нормализованы на Рисунке 8 B .Также на Фигуре 8 B приведена нормализованная средняя тусклая вспышка от стержня, обесцвеченного на 50% (розовый), в котором родопсин не регенерировался. Как и ожидалось, этот след имеет значительно более быстрый временной ход из-за адаптации опсина (Cornwall and Fain, 1994; Nymark et al., 2012).
Данные, представленные на рисунках 7 и 8, и данные в таблице 2 показывают, что, в то время как SQR, возникающий из фосфорилированного родопсина, имеет пониженную амплитуду, время ответа оказалось одинаковым между SQR, полученным из нефосфорилированного родопсина (0% P-родопсина) и фосфорилированные родопсины (50% P-родопсина и 90% P-родопсина; рис.7). Анализ вариабельности ответов не показал различий между тремя группами ответов. Примечательно, что Doan et al. (2006) ранее показали, что каждый фосфорилированный сайт обеспечивает независимую стадию дезактивации родопсина, что в совокупности обеспечивает воспроизводимость SQR палочки за счет генетической элиминации фосфорилируемых сайтов на родопсине (Doan et al., 2006; Azevedo et al., 2015). Наш эксперимент противоположен их подходу; мы не удалили фосфорилируемые сайты, а скорее префосфорилировали их, и наш анализ не выявил этой вариации в воспроизводимости SQR.Однако мы должны проявлять осторожность при интерпретации этих данных. Для правильной оценки вариабельности отклика (коэффициента вариации) требуется запись с очень низким дрейфом, сотовый шум, превышающий инструментальный шум как минимум в два раза, и способность разрешать все однофотонные отклики, учитывая, что большая часть дисперсии возникает из-за откликов на хвостах распределения амплитуды. Хотя проблемы, отмеченные выше, ограничивали углубленный анализ шума, мы заметили, что усредненный SQR может точно отражать кинетику и амплитуду отдельных SQR при различных условиях фосфорилирования родопсина (рис.8).
Обсуждение
Влияние P-родопсина на зрительную чувствительность
Основные результаты нашей работы заключаются в том, что стержни мышей, подвергнутые яркому свету в присутствии 11- цис- сетчатки, содержат значительную долю своего родопсина в фосфорилированном виде. форма, которая спектрально идентична родопсину в основном состоянии, и ее световая активация приводит к физиологическим ответам с уменьшенными амплитудами, но с кинетикой, подобной состоянию адаптации к темноте. Модель, которая объединяет эти результаты на каскаде фототрансдукции, показана на рисунке 9.Поле на Фигуре 9 показывает, что нефосфорилированный родопсин (R) и фосфорилированный родопсин (R-P) сосуществуют и вызывают разные амплитуды ответа. После световой активации нефосфорилированный родопсин образует R * [метародопсин II (MII)], который максимально активирует трансдуцин G-белка. Степень активации трансдуцина (G) указана жирными стрелками. MII быстро фосфорилируется в течение десятков миллисекунд с образованием MII-P, который запускает высокоаффинное связывание Arr1 с образованием MII-P · Arr1, в котором каталитическая активность родопсина полностью подавляется.Затем сетчатка All- trans постепенно высвобождается из MII-P · Arr1, оставляя фосфорилированный опсин, который имеет пониженное сродство к Arr1. Поскольку большие количества MII-P · Arr1 накапливаются под воздействием яркого света и потому что реакция дефосфорилирования P-опсина является медленной in vivo , высокие уровни P-родопсина образуются при восстановлении P-опсина 11- цис- сетчатки (Lee et al., 2010). Кроме того, активируемый светом P-родопсин имеет пониженную способность активировать трансдуцин (одна жирная стрелка).
Рис. 9.
Модель, иллюстрирующая влияние R-P на каскад фототрансдукции. При стимуляции светом активированный родопсин ( R * или MII) взаимодействует с трансдуцином G-белка (G), инициируя фототрансдукцию (обозначено 2 жирными стрелками). Родопсинкиназа (GRK1) быстро фосфорилирует R * с образованием MII-P в процессе, который снижает его способность активировать трансдуцин (как показано только 1 жирной стрелкой). Вскоре после этого каталитическая активность MII-P прекращается за счет связывания с Arr1 с образованием MII-P · Arr1.После этого этапа фосфо-опсин (Op-P · Arr1) гидролизуется из всего- транс- сетчатки, который рециклируется в RPE (данные не показаны). Пунктирная стрелка указывает на то, что сам опсин имеет очень низкую трансдукционную активность. Регенерация пигмента происходит, когда фосфо-опсин (Op-P) рекомбинирует с сетчаткой 11- цис- (поступает из RPE) с образованием фосфо-родопсина (R – P). Фосфо-родопсин может медленно дефосфорилироваться родопсинфосфатазой или реактивироваться светом. Последний результат приводит к снижению активации трансдуцина (G).
Важным проявлением способности P-родопсина активировать трансдуцин является уменьшенная амплитуда SQR. Предыдущие исследования природы и кинетики SQR были проведены на полностью адаптированных к темноте стержнях и, следовательно, отражают активность R *, продуцируемого из родопсина в его нефосфорилированной форме. Насколько нам известно, наше исследование является первым, которое характеризует SQR, возникающие из P-родопсина, регенерированного во время воздействия экзогенного 11- цис- сетчатки. Наше сравнение SQR для родопсина и P-родопсина показывает, что усиление фототрансдукции снижается по мере увеличения концентрации P-родопсина.Мы экстраполируем из наших данных, что снижение прироста будет составлять ~ 50% для P-родопсина, значение, подобное наблюдаемому в стержнях Arr1 ^{— / —}, в которых каталитическая активность P-родопсина также составляла ~ 50%. пикового значения (Xu et al., 1997). Этот результат согласуется с биохимическими исследованиями, показывающими снижение эффективности активации трансдуцина фотолизированным P-родопсином (Miller et al., 1986; Wilden et al., 1986; Bennett and Sitaramayya, 1988; Wilden, 1995), еще на один пункт. подтверждается нашими расчетами констант усиления.Хотя данные IEF показывают, что P-родопсин представляет собой гетерогенную популяцию, включающую родопсин, который имеет от одного до шести прикрепленных фосфатов, ранее было показано, что одного или двух прикрепленных фосфатов достаточно для снижения усиления фототрансдукции наполовину (Mendez et al., 2000 ). Хотя это снижение чувствительности может показаться относительно незначительным по сравнению с потерей чувствительности, вызванной обесцвечиванием, ожидаются более серьезные последствия для заключительных фаз адаптации к темноте к абсолютному порогу зрения.Здесь размер SQR имеет важное значение. Обнаружение SQR палочковыми биполярными клетками, первичным синаптическим выходом палочковых фоторецепторов в сетчатке млекопитающих (Dacheux and Raviola, 1986), требует прохождения ответов через нелинейный синаптический порог в биполярном синапсе стержень-стержень. (Филд и Рике, 2002). В полностью адаптированных к темноте условиях синаптическое насыщение делает биполярный ток стержня нечувствительным к небольшим изменениям в высвобождении передатчика стержня. Этот механизм служит для улучшения визуальной чувствительности за счет подавления шума от стержней, которые не поглощают фотоны.Т.о., чтобы SQRs точно передавались в палочковидные биполярные клетки, их размер должен быть достаточно большим, чтобы снимать насыщение в синапсах биполярных клеток между стержнями (Sampath and Rieke, 2004). Эта нелинейность в передаче сигнала, вероятно, отфильтрует небольшие SQR, возникающие из P- R *, и тем самым снизит чувствительность на пороге зрения во время адаптации к темноте. Это важно, потому что на самых низких четырех порядках величины в видимом диапазоне (от захвата одного фотона на 10 000 стержней до захвата одного фотона на стержень) скотопическое зрение зависит исключительно от обнаружения отдельных фотонов.
Эффекты P-родопсина на связывание Arr1
В палочках ступенчатая дезактивация родопсина происходит следующим образом: (1) связывание GRK1 с MII; (2) конкуренция Arr1 со связыванием GRK1; (3) связывание фосфата, катализируемое GRK1, с образованием MII-P; (4) активация Arr1; и (5) связывание Arr1 с MII-P, которое полностью гасит каталитическую активность родопсина (фиг. 9). Все шаги способствуют формированию кинетики и изменчивости SQR (Doan et al., 2006, 2009). Arr1 существует в базальном состоянии, которое переходит в компетентную для связывания конформацию при столкновении с MII-P (Gurevich et al., 2011). Arr1 в базальном состоянии конкурирует с GRK1 и замедляет дезактивацию MII (Doan et al., 2009). Поскольку GRK1 последовательно добавляет фосфаты к MII, взаимодействие MII-P с Arr1 может быть более предпочтительным, чем GRK1. Сравнивая SQR, генерируемые родопсином и P-родопсином, мы имеем уникальную возможность исследовать, является ли GRK1 катализируемое фосфорилирование MII или активация Arr1 и связывание с MII-P ограничением скорости дезактивации MII. Если MII-P имеет значительно более высокое сродство к Arr1, то SQR, генерируемые P-родопсином, должны дезактивироваться быстрее по сравнению с SQR, генерируемыми из R *, что по-прежнему требует дополнительных этапов присоединения фосфата с помощью GRK1.И наоборот, если активация Arr1 ограничивает скорость, то скорость восстановления должна оставаться такой же. Мы наблюдали, что SQR, генерируемые из родопсина и P-родопсина, демонстрируют сходную кинетику ответа. Это сходство предполагает, что сродство Arr1 к MII нечувствительно к присоединению фосфата и что активация Arr1 является медленной ступенью в подавлении каталитической активности MII-P.
Недавнее исследование взаимодействия Arr1 с различными функциональными формами родопсина с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса в растворе показывает, что сродство Arr1 к P-родопсину было достаточно высоким, так что, как предполагается, активный мономерный Arr1 во внешнем сегменте связывает P-родопсин в неповрежденный стержень (Zhuang et al., 2013). Однако наше наблюдение, что эффективность генерации SQR с помощью P-родопсина практически идентична эффективности SQR в основном состоянии, указывает на то, что Arr1 не связывается с P-родопсином таким образом, который не позволяет фотолизованному P-родопсину генерировать световой ответ.
Фосфорилированный родопсин, зрительный цикл и адаптация к темноте
Зрительный цикл определяется как совокупность биохимических реакций, происходящих в нервной сетчатке и РПЭ, посредством которых зрительный пигмент после обесцвечивания возвращается в свое полностью функциональное основное состояние, содержащее 11- цис- сетчатки.Поскольку родопсин не может быть определен как находящийся в основном состоянии до тех пор, пока он не будет полностью дефосфорилирован, мы утверждаем, что дефосфорилирование родопсина является критическим шагом в зрительном цикле (Lee et al., 2010).
Палочки позвоночных обладают способностью претерпевать огромные изменения в своей чувствительности в ответ на различия в фоновом освещении и интенсивности отбеливающего света. Это наделяет их способностью реагировать в диапазоне от трех до четырех порядков силы света. Клеточные механизмы, которые были идентифицированы внутри палочек, которые ответственны за эти изменения, включают следующее: (1) управляемое трансдукцией снижение концентрации цитозольного кальция, которое, в свою очередь, модулирует активность цГМФ-фосфодиэстеразы, гуанилилциклазы и регенерина внутри палочек. внешние сегменты; (2) увеличенное время жизни фотопродуктов обесцвечивания родопсина, что приводит к стойкой активации каскада трансдукции; (3) отбеливание родопсина, которое из-за его пониженной концентрации во внешнем сегменте снижает квантовый улов; и (4) транслокация трансдуцина из внешнего во внутренний сегмент палочек, приводящая к снижению активации трансдуцина на R *.Наши результаты, которые показывают, что высокие уровни P-родопсина могут сохраняться во внешних сегментах палочек в течение многих минут после воздействия яркого света и что его фотоактивация активирует трансдуцин с пониженной эффективностью, предполагают, что этот механизм адаптации должен быть добавлен к приведенному выше списку. За исключением самых высоких уровней фосфорилирования родопсина, это снижение чувствительности невелико, но, по прогнозам, оно будет иметь наиболее значимые эффекты вблизи порога зрения.
Почему дефосфорилирование родопсина притупляется в изолированной сетчатке млекопитающих?
Наше наблюдение, что изоляция сетчатки от глаза мыши приводит к существенному ингибированию дефосфорилирования родопсина, является новым и неожиданным.Важно отметить, что биохимические и электрофизиологические измерения изолированной сетчатки и одиночных фоторецепторных клеток в тех же условиях, которые мы описываем здесь, были рутинными более 40 лет. Таким образом, в нашей документации подчеркивается, что изоляция сетчатки от интактного животного может иметь важные последствия для этих исследований. Кроме того, мы демонстрируем, что низкое давление кислорода в среде суперфузии и / или присутствие лактата способствуют дефосфорилированию. Эти последние результаты ясно указывают на участие метаболических механизмов в регуляции дефосфорилирования родопсина, но не дают понимания конкретных механизмов.

Определить реакции стержней и , общий шарнир которых нагружен

Расчетно-графическая работа. Определение реакций связей. Аналитический способ.

Раздел I самостоятельные и контрольные работы

Глава 1 теоретическая механика. Статика

1.1. Определение реакций идеальных связей аналитическим способом

Решение задач определить 📝 реакции стержней удерживающих грузы f1 и f2 м

Вариант 1. Задание 1 Определить аналитически и графически реакции стержней, удерживающих грузы весом F 1 =4 кн, F 2 =6 кн. Массой стержней пренебречь.

Новосибирский государственный архитектурно-строительный университет — Сибстрин

Плоская система произвольно расположенных сил

Механика Плоская система произвольно расположенных сил

Читайте также

Механика материалов: кручение »Механика тонких конструкций

Определение базальной активности фосфодиэстеразы в фоторецепторах палочек мышей с помощью зажима cGMP

Экспериментальное

Этическое разрешение

Животные и препараты

Регистрирующая камера, записи и перфузия

Световая стимуляция

Сбор данных

Моделирование откликов на вспышку

1 Введение

2 Результаты и обсуждение

Рис. 1:

Рис. 2:

Рис. 3:

Рис. 4:

Рис. 5:

Рис. 6:

3 Заключение

4 Экспериментальная часть

4.1 Химический список

4.2 Синтез затравок CdSe

4.3 Синтез наностержней CdS с затравкой CdSe

4.4 Определение характеристик

4.4.1 Абсорбционная спектроскопия в УФ-видимом диапазоне

4.4.2 Атомно-абсорбционная спектроскопия (AAS)

4.4.3 Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Список литературы

Дополнительные материалы:

Руководство по лаборатории менингита: идентификация и характеристика Hib

Сноски

Список литературы

грамм красителя | Лабораторные тесты онлайн

Анализ in vivo точечных мутаций, связанных с заболеванием, выявил глубокие различия в сплайсинге мРНК периферина-2 в палочковидных и конусных фоторецепторах

Abstract

Сведения об авторе

Введение

Результаты

Минигены rAAV-PRPh3 обеспечивают эффективную экспрессию PRPh3 в палочках и колбочках

Сравнительный сплайс-анализ минигенов PRPh3 дикого типа и мутантных в палочках и колбочках

Полуколичественный анализ изоформ сплайсинга PRPh3

Количественный анализ нативных изоформ сплайсинга PRPh3

Изоформа PRPh3, кодируемая экзоном 1, неправильно локализована в фоторецепторах

Экспрессия белка и локализация мутантов PRPh3 в палочках и колбочках

Сплайсинг и экспрессия белка палочко-доминантного мутанта PRPh3 в колбочках и мутантного доминантного конуса в палочках

Обсуждение

Материалы и методы

Заявление об этике

Животные

Конструирование и клонирование минигенов PRPh3

In silico предсказание сварки

Сплайс-анализ и количественное определение изоформ, полученных из минигена PRPh3, в стержнях и колбочках

Производство rAAV и субретинальные инъекции

Иммуногистология и вестерн-блоттинг

FAC-сортировка стержней и конусов

Выделение РНК и синтез кДНК

Количественная ПЦР

Дополнительная информация

S1 Рис. Точечные мутации в PRPh3, связанные со специфическим заболеванием экзона 2.

S2 Рис. Анализ репрезентативной последовательности продуктов сплайсинга PRPh3.

S3 Рис. Определение диапазона линейной амплификации ОТ-ПЦР для минигенов PRPh3.

S4 Рис.Репрезентативная фотография глазного дна сетчатки мыши, инъецированной одиночными минигенами PRPh3.

S5 Рис. Сумма абсолютных интенсивностей полос минигенов PRPh3 в палочках и колбочках.

S6 Рис. Перекрестная экспрессия одного палочко-доминантного мутанта PRPh3 в колбочках и одного конус-доминантного мутанта в палочках.

S1 Таблица.

Благодарности

Вклад авторов

Список литературы

Влияние фосфорилирования родопсина на адаптацию к темноте у палочек мышей

Abstract