Расход раствора при монтаже фбс блоков: Норма расхода раствора на монтаж блоков ФБС: пример расчета

Содержание

Норма расхода раствора на монтаж блоков ФБС: пример расчета

Содержание

  1. Расход раствора на ФБС блоки:
  2. Достоинства строительных элементов:
  3. Отрицательные характеристики стройматериала:
  4. Монтажные работы
  5. Особенности укладки
  6. Постройка прерывистого ленточного фундамента из блоков ФБС
  7. Ход работ:

ФБС – фундаментные блоки стен, подходящие для сооружения зданий различного предназначения. При эксплуатации допустимы колебания температур не выше +50 и не ниже -70 градусов Цельсия. Применение элементов из бетона ФБС при возведении домов в различных климатических условиях и на разных видах почвы. В сравнении с монолитным типом фундаментной конструкции, монтаж блоков ФБС производят при различных погодных условиях, а приступить к укладке стен, рекомендуется после того как работы по установке конструкции будут завершены. Норма расхода раствора на монтаж блоков ФБС будет составлять 10-20% от объемной части строительных элементов. Многое будет зависеть от типа и габаритов изделий.

Зная расход раствора на монтаж блоков ФБС, осуществляют установку строительных единиц за кратчайший период и при этом не привлекают квалифицированных мастеров для произведения расчетов. Такая методика позволит существенно сократить список расходов и при этом не потерять характеристики качества и надежности возводимой постройки.

Популярные марки сборных бетонных блоков:

  • ФБС 24-4-6;
  • ФБС 12-4-6;
  • ФБС 9-4-6;
  • ФБС 6-4-6.

Характеристики плотности блочного материала – 2,15 т/м3. Плотность строительной смеси 1,55 т/м3. Расход раствора при монтаже блоков ФБС составит 0,07 м3 на 1 м3 кладки. Для примера возьмем раскладку блоков для фундаментного основания из 28 строительных единиц тип ФСБ 12-4-6 и 8 блоков ФБС 9-4-6.

V (бет.бл.) = S(бет.) х H(кладки) = 8,21м2х1,23м = 10,09м3

Расход раствора на ФБС блоки:

V(раствора) = 0,07 х V (бет.) = 0,07х10,09м3 = 0,7м3;

m(раствора) =1,55m/м3 х 0,7м3 = 1,08 m;

Формула расчета общей массы бетонных блоков:

m(бет. блока) = 2,15m/м3 х 28 х V (12-4-6) + 2,15m/м3 х 8 х V(9-4-6) = 2,15m/м3 х 28 (1,2х0,4х0,6)+2,15m/м3 х 8 (0,9х0,4х0,6) = 21,06 m

Для того чтобы увеличить несущие особенности основы, бетонные элементы ФБС укладывают на фундаментные подошвы ФЛ. Главное качество ФЛ – возможность расширения площади опорной конструкции.

Для расчета нормы расхода раствора на кладку ФБС при строительстве фундаментов для зданий необходимо знать, что изделия имеют стандартную длину – 2,4 м, 1,2 м, 0,9 м, показатели высоты всегда равны 0,6 м. Блоки имеют ширину: 30, 40, 50, 60 сантиметров и должны быть не менее размера ширины стен здания. Общая норма расхода блоков фундамента будет равна, количеству изделий в ряду, умноженному на нужное количество рядов.

Достоинства строительных элементов:

  • быстрота и простота монтажа достигается за счет фиксированной конструкции бетонных изделий;
  • высокие показатели практичности. Каждая строительная единица изготовлена на заводском производстве с четкими соблюдениями норм и правил СНиП и ГОСТ;
  • длительные сроки эксплуатации;
  • небольшой расход раствора на монтаж ФБС;
  • благодаря добавлению в сырье при изготовлении специальных присадок, которые увеличивают стойкость к минусовым температурам.

Отрицательные характеристики стройматериала:

  • высокая итоговая стоимость фундаментного основания – транспортировка на строительный участок и применение услуг спецтехники при монтаже;
  • при укладке требуется дополнительно проложить гидроизоляционный материал. В основной состав блоков входит бетон, который имеет хорошую восприимчивость к влажной среде;
  • потребуется теплоизоляционный защитный слой. Самое слабое место фундаментной конструкции из ФБС – соединительные швы. В зимний период сезона повышенное количество атмосферных осадков в сочетании с сильными морозами негативным образом отражаются на связующей смеси для блоков. Что приводит к образованию пустот и нарушению целостности фундамента.

Почему блоки ФБС для основы лучше, чем сооружение монолитного фундамента? Существенным плюсом является, то, что фундаментные блоки стен возводят при любых типах грунта и в любых климатических зонах. В сравнении с монолитным основанием, производить монтаж блоков ФБС можно при различной погоде. Но, устанавливать фундамент на поверхность, покрытую слоем грязи, воды, либо снежной массы не допустимо.

Монтажные работы

  1. Строительную площадку расчищают.
  2. Производят разметку местности.
  3. Копают котлован или траншею, с расчетом ширины для свободной кладки блоков.
  4. Производят выравнивание грунтовой основы до проектных данных.
  5. Если тип грунта песчаный, монтаж следует производить непосредственно на песчаную подошву, которую следует утрамбовать тщательным образом. Рекомендованная толщина 5-10 сантиметров.
  6. Габариты основы из песка делают на 20-30 сантиметров больше размеров фундаментных элементов, это требуется для предотвращения изделий с песчаной подушки.
  7. Перед монтажом в углах и в зонах пересечения стен устанавливают маячные элементы.
  8. Отвес опускается с осевых проволочных конструкций, которые натягивают по периметру.
  9. Перед стыковкой строительных элементов, нужно проверить что техника расположена на безопасном расстоянии от края котлована, а его опорные части находятся вне зоны возможного обрушения грунта.

Монтажные блоки укладывают на строительную смесь по типу кирпичной кладки. Стандартные размеры высоты – 4-5 рядов. При этом необходимо произвести обвязку внутренних и внешних стен. ФСБ укладывают на бетонный раствор с перевязкой швов по вертикали, рекомендованная глубина – не меньше 0.4 от высоты строительной единицы при малосжимаемом типе грунта и не меньше 60 см — полная высота блока при сильносжимаемом, посадочном и влаговпитывающем типе грунта. Наиболее подходящая смесь – 1 часть цемента М500 и 3 части песка.

Особенности укладки

Укладывают изделия на бетонную смесь, толщина которой составляет 2 см. Чтобы качество швов получилось лучшим, раствор нужно выравнивать рейкой по периметру. Межблочные швы по вертикали и горизонтали заполняют раствором и расшивают с обеих сторон.

Стыки по вертикали во время монтажных работ заполняют бетоном, уплотнение производят методикой штыкования. Когда размеры длины фундаментных изделий не кратны длине сторон постройки, промежуточные зоны заполняют доборными элементами либо монолитными пломбами. При укладке, между блоками следует оставлять место для электропроводки и трубопровода.

В варианте, когда размер блока ленточного сборного фундамента тоньше, чем стена самого дома, по причине того, что надземная часть изготовлена из менее прочного стройматериала. По нормативам допустим свес стен постройки не больше 13 сантиметров.

Небольшие отклонения рекомендуется устранять, изделия передвигаются при помощи лома. Если блок установлен с отклонениями, которые превышают допустимую норму, его, следует выравнивать краном. Элемент поднимают, после отводят в сторону, основу выравнивают.

Установка фундаментных элементов на песок может привести в дальнейшем к проблемам, потому что песок подвержен размытию грунтовыми водами, что увеличивает риск возникновения перекоса постройки.

Постройка прерывистого ленточного фундамента из блоков ФБС

Перед тем как приступить к работам по монтажу фундаментных стеновых блоков, рекомендуется по всем правилам подготовить подушку под фундамент.

Ход работ:

  1. Когда грунт под фундамент будет изъят из траншеи, ее дно утрамбовывают.
  2. Монтируется каркас, лучше его сбить из брусков. Габариты рамы должны быть больше на 20-30 сантиметров от размера подушки фундаментной основы. Конструкция монтируется на дно котлована, ее расположение должно быть строго горизонтальное.
  3. Все внутреннее пространство засыпают песком. Рекомендованная толщина слоя не меньше 15 см.
  4. Песчаный слой равняют рейкой и обильно поливают водой. По мере того как он будет оседать песок досыпают еще, снова трамбуют и поливают водой. Эта методика используется для полной ликвидации скопления воздуха.
  5. В качестве второго слоя в 5 см послужит щебенка с фракцией 2-4 см. Щебень разравнивают и трамбуют.
  6. Для увеличения прочности фундаментной основы из стенового блока, следует сделать армопояс. Рекомендуется использовать арматуру марки Ф12. Стержни укладывают и сваривают. Каркас формируют из проволоки D4.
  7. Металлический каркас заливают бетонным составом, толщина слоя 20 см и ширина 30 см.

Далее работы приостанавливаются на 2-3 суток, бетон должен полностью затвердеть.

Нельзя чтобы под подошвой фундаментной основы оставался насыпной либо разрыхленный грунт.

ФБС 24-4-6 с по стандарту: ГОСТ 13579-78

НаименованиеДлинаШиринаВысота

1. Описание и применение.

Фундаментные блоки являются конструктивной частью остова здания. Они устанавливаются при возведении подземной части домов, подвалов и технических подпольев. Конструкции успешно используются в малоэтажном строительстве, которое проводится в климатической зоне Кемеровского района. Высокопрочные изделия могут иметь сплошную форму сечения или изготавливаться с вырезом и пустотами. По согласованию с заказчиком они могут выполняться с монтажными петлями или без них. В последнем случае подъем изделий осуществляется с использование захватных устройств.

Компания «Ассортимент ЖБИ Кемерово» изготавливает и реализует

фундаментные блоки, цена типоразмеров легко определяется по каталогу продукции. На сайте можно сразу оформить онлайн заказ и отправить его квалифицированным специалистам для комплектации и организации перевозки. Коммуникабельные и внимательные сотрудники учтут Ваши требования и окажут полную информационную поддержку. Воспользуйтесь удобной многоканальной линией для связи и позвоните нам по телефону (3842) 452-372!

2. Особенности производства.

а) Способы.

ФБС блоки фундаментные изготавливаются в специальных формах с учетом условий эксплуатации, требований проекта и климатологии Кемеровского района. Технический персонал применяет кассетный или агрегатно-поточный метод изготовления и контролирует прочность бетона на проектной и отпускной стадии.

Тип конструкции монтажных петель определяется требованиями ГОСТ. Они устанавливаются в проектное положение согласно схемам и чертежам рабочей документации.

Поставка фундаментных блоков на объекты в Кемеровский район производится по достижении бетоном показателя отпускной прочности. При реализации керамзитобетонных изделий производится контроль влажности бетонной смеси, который не должен превышать 12%.

б) Материалы.

У нас Вы найдете качественные блоки фундаментные, размеры влияют на расход материалов. Характеристики бетона, заполнителя, добавок и стали подбираются с учетом требований каждого конкретного проекта. Класс основного материала для бетонирования принимается в диапазоне от В3.5 до В15. Для изготовления изделий используется тяжелый, силикатный или керамзитобетон. Для производства монтажных петель применяется стержневая сталь класса А-I или Ас-И. Марка арматуры принимается с учетом климатологии Кемеровского района.

в) Нормы и стандарты.

Наш технический персонал проводит маркировку, приёмку и контроль каждой партии продукции, руководствуясь требованиями ГОСТ, фундаментные блоки сертифицируются после проведения испытаний и проверки изделий на прочность, водонепроницаемость и морозостойкость. Исследования производятся в лабораториях неразрушающими методами. Квалифицированные специалисты осуществляют сплошной контроль с отбраковкой блоков, не соответствующих заявленным данным. Они оцениваются конструкции на точность геометрических параметров, качество бетонной поверхности и правильность нанесения ориентирующих надписей и знаков.

Вы занимаетесь малоэтажным строительством и возводите здания различного назначения? У нас Вы найдете конструкции без дефектов по доступной цене. Оцените выгодность партнёрства с профессионалами и получите гарантию качества на все типоразмеры фундаментных блоков! Спешите заключить договор о долгосрочном сотрудничестве? Свяжитесь с нашими менеджерами для обсуждения условий по телефону

(3842) 452-372 или отправьте запрос с контактными данными на адрес kemerovo@tdajbi. ru!

3. Особенности транспортировки и складирования.

Компания «Ассортимент ЖБИ Кемерово» предлагает купить высокопрочные конструкции для возведения устойчивых фундаментов зданий и сооружений. У нас Вы найдете внимание к Вашим требованиям и оперативность в решении Ваших задач. Мы поддержим динамичный темп строительства малоэтажного дома или технического подполья своевременной поставкой блоков на объекты в Кемеровский район. Хотите сделать заказ? Воспользуйтесь онлайн формой заявки для быстрой покупки изделий! Вам нужно согласовать порядок оплаты? Свяжитесь с нашими консультантами по многоканальной линии (3842) 452-372.

Блоки фундаментные будут отгружены с собственных складов с соблюдением техники безопасности. У нас конструкции хранятся в штабелях высотой до 2.5м с применением прокладок толщиной 30мм. Опытный персонал установит бетонные изделия на транспортные средства, применит инвентарные подкладки и закрепит груз прежде, чем начать перевозку. Мы используем речной, автомобильный или железнодорожный подвижной состав и осуществим своевременную доставку прямо на Ваш объект.

Вы стремитесь выполнять строительно-монтажные работы строго по графику? Компания «Ассортимент ЖБИ Кемерово» поддержит Ваш динамичный темп своевременными поставками и обеспечит объекты только качественной продукцией. Сделайте шаг навстречу перспективным отношениям и оформите заказ на наши фундаментные блоки!

Оценка активности сфингозин-1-фосфата в биологических образцах путем интернализации рецепторов и образования адгезивных соединений

Methods Mol Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2013 2 апреля.

Опубликовано в окончательной редакции как:

Methods Mol Biol. 2012 г.; 874: 69–76.

doi: 10.1007/978-1-61779-800-9_6

PMCID: PMC3614356

NIHMSID: NIHMS452351

PMID: 22528440

Информация об авторских правах и лицензиях Отказ от ответственности

Сфингозин-1-фосфат (S1P) представляет собой биологически активный липидный медиатор, участвующий во многих биологических процессах, включая сосудистый гомеостаз и перемещение иммунных клеток. Активность S1P опосредуется специфическими рецепторами, связанными с G-белком, что приводит к множественным физиологическим реакциям, включая образование слипчивых соединений в эндотелиальных клетках. Здесь мы описываем биоанализы для быстрой оценки активности S1P в биологических жидкостях на основе индуцированной лигандом интернализации рецепторов в трансфицированных клетках HEK293 и последующего образования адгезионных соединений эндотелиальных клеток сосудов.

Ключевые слова: Биоанализ, Сфингозин-1-фосфат, Рецептор, GFP, Интернализация, Слипчивое соединение, Иммунофлуоресцентное окрашивание йелиназа , церамидаза и сфингозинкиназа (1, 2). S1P обогащен в крови и лимфе в субмикромолярном диапазоне, тогда как S1P в интерстициальной жидкости тканей значительно ниже, создавая крутой градиент S1P (1). Этот сосудистый градиент S1P используется для регуляции транспорта иммунных клеток, таких как лимфоциты, гемопоэтические клетки-предшественники и дендритные клетки (1, 3-6). S1P также играет важную роль в созревании сосудов, ангиогенезе и сосудистой проницаемости как на стадиях развития, так и у взрослых (1, 7). S1P также участвует в развитии рака (8). Таким образом, очень важно знать, когда и где производится S1P, для лучшего понимания его функций.

Было разработано несколько методов измерения уровней S1P с использованием тонкослойной хроматографии (9, 10), высокоэффективной жидкостной хроматографии (11–15) или жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (16, 17). Хотя эти методы могут обеспечить приемлемые значения концентрации S1P, они обычно включают специализированные и трудоемкие процедуры, такие как радиоактивное мечение, извлечение S1P из неочищенных образцов и дериватизация.

В этой главе мы описываем биоанализы для быстрой оценки активности S1P в биологических жидкостях на основе функций специфического рецептора S1P. Биологические функции S1P опосредуются рецепторами, связанными с G-белками клеточной поверхности (18). Среди пяти идентифицированных рецепторов (S1P 1 -S1P 5 ), прототип рецептора S1P 1 хорошо охарактеризован. S1P 1 быстро интернализуется при стимуляции лигандом через эндосомальный путь и постепенно рециркулирует обратно на плазматическую мембрану в клетках HEK293 (19). Активация S1P 1 вызывает несколько внутриклеточных сигнальных каскадов, ведущих к пролиферации, продукции NO, перестройке актинового цитоскелета и образованию адгезивных соединений в эндотелиальных клетках (1, 20). Основываясь на этих наблюдениях, мы описываем здесь S1P 1 Анализ интернализации и визуализация адгезионных соединений в качестве инструментов для оценки активности S1P с использованием флуоресценции GFP, слитого с С-концом рецептора, и стандартного метода иммунофлуоресцентного окрашивания VE-кадгерина соответственно. Хотя эти биоанализы дают только приблизительную оценку активности S1P, специфичность для S1P и простота процедур обеспечивают хорошие возможности для начальной оценки активности S1P. Эти анализы также можно применять для разработки агониста/антагониста S1P 9.0031 1 рецептор.

  1. ячейки HEK293.

  2. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM).

  3. Фетальная телячья сыворотка (ФБС).

  4. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC, пассаж 4–10).

  5. Средний 199 (M199).

  6. Фосфатно-солевой буфер (PBS).

  7. Раствор фибронектина: 50 мкг/мл в PBS.

  8. Гепарин.

  9. Добавка для роста эндотелиальных клеток (Biomedical Technologies, Inc.).

  10. Вектор экспрессии для клеток млекопитающих (см. примечание 1).

  11. Реагент для липофекции.

  12. Уголь древесный (см. примечание 2).

  13. Фильтры для шприцев, поры 0,45 и 0,2 мкм.

  14. Тарелки со стеклянным дном 35 мм.

  15. 4% раствор параформальдегида (см. примечание 3).

  16. Раствор для пермеабилизации: 0,2% Triton X-100 в PBS.

  17. Блокирующий раствор: 2% бычий сывороточный альбумин и 0,1% Тритон Х-100 в PBS.

  18. Антитело к VE-кадгерину (см. Примечание 4).

  19. Вторичное антитело, конъюгированное с флуоресцентным красителем (см. примечание 5).

  20. Родамин фаллоидин (см. примечание 6).

  21. Краситель для окрашивания ядер (см. примечание 7).

  22. Конфокальный микроскоп.

3.1. Культура клеток

Клетки HEK293 культивируют в среде DMEM с добавлением 10% FBS. HUVEC культивируют на чашках, покрытых фибронектином, в среде M19.9 с добавлением 10% FBS, 50 мкг/мл добавки для роста эндотелиальных клеток и 5 ЕД/мл гепарина. Клетки поддерживают при 37°C во влажном инкубаторе с 5% CO 2 .

3.2. Подготовка клеток HEK293, стабильно экспрессирующих слитый белок S1P

1 -GFP (клетки 293-S1P 1 -GFP)

Создайте вектор экспрессии для слитого белка S1P 1 -GFP. С-концевой терминирующий кодон S1P 1 следует удалить. Трансфекция клеток HEK293 с помощью S1P 1 — Вектор экспрессии GFP методом липофекции в соответствии с инструкциями производителя. После отбора выбранным антибиотиком изолируйте несколько отдельных клонов методом лимитирующего разведения. Кроме того, выберите клоны, которые показывают хорошую поверхностную локализацию S1P 1 с помощью флуоресцентной микроскопии.

3.3. Приготовление очищенной углем FBS

Поскольку содержание S1P в сыворотке высокое, FBS следует обрабатывать углем для удаления S1P.

  1. Возьмите 2,5 г активированного угля в коническую пробирку объемом 50 мл.

  2. Промойте уголь дистиллированной водой три раза.

  3. Добавьте в пробирку 25 мл FBS.

  4. Вращать в течение ночи при 4°C.

  5. Центрифуга при 1200 × г в течение 15 мин.

  6. Дважды отфильтруйте супернатант через шприцевые фильтры, сначала с размером пор 0,45 мкм, а затем с размером пор 0,2 мкм.

  7. Храните очищенную углем FBS при 4°C до использования (см. примечание 8).

3.4. Анализ интернализации рецептора

  1. Чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм покрывают раствором фибронектина не менее 10 мин при комнатной температуре (см. примечание 9).

  2. Приготовьте суспензию клеток 293-S1P 1 -GFP с плотностью 1,5 × 10 5 /мл в среде DMEM, содержащей 2 % FBS, очищенной от угля (см. примечание 10).

  3. Аспирируйте раствор фибронектина из чашек и добавьте в каждую чашку по 1 мл клеточной суспензии.

  4. Инкубируйте чашки в течение ночи в CO 2 инкубатор.

  5. Замените среду простой DMEM для сывороточного голодания (см. примечание 11).

  6. Инкубировать в течение 2 часов в инкубаторе CO 2 .

  7. Аспирируйте среду и добавьте интересующий раствор в чашки (см. примечание 12).

  8. Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе CO 2 (см. примечание 13).

  9. Фиксируют клетки 1 мл/чашку 4% раствора параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре (см. примечание 3).

  10. Дважды промыть клетки PBS (см. примечание 14).

  11. Осмотрите клетки с помощью конфокального микроскопа ().

    Открыто в отдельном окне

    293-S1P 1 -GFP клетки стимулировали контрольным раствором ( a ) или 100 нМ S1P в течение 1 ч ( b ). Масштабная линейка, 10 мкм.

3.5. Adherens Junction Formation

3.5.1. Подготовка и стимуляция клеток

  1. Покройте 35-мм чашки со стеклянным дном раствором фибронектина в течение не менее 10 минут при комнатной температуре.

  2. Приготовьте суспензию HUVEC с плотностью 1 × 10 5 /мл в M199, содержащую 1% FBS, очищенного от угля (см. примечание 15).

  3. Аспирируйте раствор фибронектина из чашек и добавьте в каждую чашку по 1 мл клеточной суспензии.

  4. Инкубируйте чашки в течение ночи в инкубаторе CO 2 .

  5. Замените носитель на простой M199 (см. Примечание 11).

  6. Инкубировать в течение 2 ч в CO 2 инкубатор.

  7. Аспирируйте среду и добавьте интересующий раствор в чашки (см. примечание 12).

  8. Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе CO 2 (см. примечание 13).

  9. Фиксируют клетки 1 мл/чашку 4% раствора параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре (см. примечание 3).

  10. Дважды промыть клетки PBS (см. примечание 14).

3.5.2. Иммунофлюоресцентное окрашивание VE-кадгерина

Все процедуры проводят при комнатной температуре.

  1. Аспирируйте PBS и добавьте 1 мл/чашку пермеабилизирующего раствора. Инкубируйте в течение 3 мин.

  2. Аспирируйте пермеабилизирующий раствор и добавьте 1 мл/чашку блокирующего раствора. Инкубировать в течение 30 мин.

  3. Разведите антитело против VE-кадгерина в блокирующем растворе (см. примечание 4).

  4. Аспирируйте блокирующий раствор и добавьте 100 мкл/чашку раствора первичных антител. Инкубировать в течение 1 ч.

  5. Трижды промыть PBS.

  6. Разведите вторичное антитело, конъюгированное с флуоресцентным красителем, в блокирующем растворе (см. примечание 5).

  7. Добавьте 100 мкл/чашку раствора вторичных антител. Инкубировать в течение 1 ч.

  8. Промыть PBS три раза.

    Если предпочтительна одновременная визуализация актиновых филаментов и ядер коры, перед микроскопическим исследованием можно выполнить следующие процедуры.

  9. Родамин фаллоидин разбавляют блокирующим буфером (см. примечание 6).

  10. Добавьте 100 мкл/чашку раствора родамина фаллоидина. Инкубировать в течение 20 мин.

  11. Промыть PBS три раза.

  12. Развести краситель для окрашивания ядер в PBS (см. примечание 7).

  13. Добавьте 100 мкл/чашку раствора для окрашивания ядер. Инкубировать в течение 10 мин.

  14. Промыть PBS три раза.

  15. Осмотрите клетки с помощью конфокального микроскопа ().

    Открыто в отдельном окне

    HUVEC стимулировали контрольным раствором ( a ) или 100 нМ S1P в течение 1 ч (b). Визуализируются VE-кадгерин ( зеленый ), кортикальные актиновые филаменты ( красный ) и ядра ( синий ). Масштабная линейка, 10 мкм.

  1. Вектор должен нести кассету устойчивости к антибиотикам, которая позволяет отбирать трансфицированные эукариотические клетки с выбранным антибиотиком. Мы обычно используем вектор pcDNA3.1 и отбираем трансфицированные клетки с 0,5 мг/мл G418.

  2. Мы используем гранулированный активированный уголь (4–8 меш), который легче удалить, чем уголь в виде порошка.

  3. Свежеприготовленный 4% раствор параформальдегида.

  4. Мы используем козье антитело против VE-кадгерина (C-19) от Santa Cruz в разведении 1:200.

  5. Мы используем конъюгированные с Alexa488 ослиные антитела против козьего IgG от Invitrogen в разведении 1:1000.

  6. Мы используем родамин фаллоидин от Invitrogen в разведении 1:500.

  7. Мы используем краситель TO-PRO-3 от Invitrogen в разведении 1:1000.

  8. Храните очищенные углем FBS при температуре −20°C для длительного хранения.

  9. Чашки со стеклянным дном могут быть покрыты другими типами адгезивных молекул, такими как коллаген, желатин и полилизин.

  10. Клетки HEK293 чрезвычайно легко отрываются от чашки, когда они образуют пластинчатую структуру. Важно поддерживать низкую плотность клеток и уменьшать количество смен среды.

  11. Не аспирируйте всю среду, а оставьте среду в области дна стакана, чтобы избежать повреждения и потери клеток. Промойте два-три раза простой DMEM, чтобы удалить FBS.

  12. Нет необходимости накрывать всю чашку, если раствор лиганда ценен. Для покрытия области дна стекла более чем достаточно 100 мкл на чашку. По возможности предпочтительнее проводить титрование образцов.

  13. Необходимо определить оптимальный момент времени.

  14. Фиксированные клетки можно хранить в PBS при 4°C в течение нескольких дней, прежде чем приступить к исследованию под микроскопом или иммунофлуоресцентному окрашиванию.

  15. Плотность клеток и условия сывороточного голодания должны быть оптимизированы таким образом, чтобы клетки находились достаточно близко друг к другу, чтобы образовывать слипчивые соединения, но все же не завершали образование соединений до стимуляции.

Мы благодарны Кэтрин Х. Лю и Шобхе Тангаде за их усилия по созданию этих биотестов. Эта работа поддерживается грантами NIH HL-67330 и HL-89.934.

1. Hla T, Venkataraman K, Michaud J. Сосудистые градиентно-клеточные источники S1P и биологическое значение. Биохим Биофиз Акта. 2008; 1781: 477–482. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

2. Тани М., Ито М., Игараши Ю. Метаболизм церамида/сфингозина/сфингозин-1-фосфата на клеточной поверхности и во внеклеточном пространстве. Сотовый сигнал. 2007; 19: 229–237. [PubMed] [Google Scholar]

3. Mandala S, Hajdu R, Bergstrom J, Quackenbush E, Xie J, Milligan J, Thornton R, Shei GJ, Card D, Keohane C, Rosenbach M, Hale J, Lynch CL, Рупрехт К. , Парсонс В., Розен Х. Изменение доставки лимфоцитов агонистами рецептора сфингозин-1-фосфата. Наука. 2002;296: 346–349. [PubMed] [Google Scholar]

4. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V, Allende ML, Proia RL, Cyster JG. Выход лимфоцитов из тимуса и периферических лимфоидных органов зависит от рецептора S1P 1. Природа. 2004; 427:355–360. [PubMed] [Google Scholar]

5. Massberg S, Schaerli P, Knezevic-Maramica I, Köllnberger M, Tubo N, Moseman EA, Huff IV, Junt T, Wagers AJ, Mazo IB, Andrian UH. Иммунонадзор за гемопоэтическими клетками-предшественниками, проникающими через кровь, лимфу и периферические ткани. Клетка. 2007;131:994–1008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

6. Czeloth N, Bernhardt G, Hofmann F, Genth H, Förster R. Сфингозин-1-фосфат опосредует миграцию зрелых дендритных клеток. Дж Иммунол. 2005; 175: 2960–2967. [PubMed] [Google Scholar]

7. Коно М., Альенде М.Л., Пройя Р.Л. Сфингозин-1-фосфатная регуляция развития млекопитающих. Биохим Биофиз Акта. 2008; 1781: 435–441. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

8. Pyne N, Pyne S. Сфингозин-1-фосфат и рак. Нат Рев Рак. 2010;10:489–503. [PubMed] [Google Scholar]

9. Yatomi Y, Ruan F, Ohta J, Welch RJ, Hakomori S, Igarashi Y. Anal Biochem. 1995; 230:315–320. [PubMed] [Google Scholar]

10. Edsall LC, Spiegel S. Ферментативное измерение сфингозин-1-фосфата. Анальная биохимия. 1999; 272:80–86. [PubMed] [Google Scholar]

11. Калиган Т.Б., Питерс К., Оу Дж., Ван Э., Саба Дж., Меррилл А.Х. Высокоэффективный жидкостный хроматографический метод для измерения сфингозин-1-фосфата и родственных соединений в анализах на сфингозинкиназы и других биологических образцах. Анальная биохимия. 2000; 281:36–44. [PubMed] [Академия Google]

12. Ruwisch L, Schäfer-Korting M, Kleuser B. Усовершенствованный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения сфингозин-1-фосфата в сложных биологических материалах. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2001; 363: 358–363. [PubMed] [Google Scholar]

13. Min JK, Yoo HS, Lee EY, Lee WJ, Lee YM. Параллельный количественный анализ сфингоидных оснований 1-фосфатов в биологических образцах методом предколоночной дериватизации o -фталальдегида после дефосфорилирования щелочной фосфатазой. Анальная биохимия. 2002; 303: 167–175. [PubMed] [Академия Google]

14. Lee YM, Venkataraman K, Hwang SI, Han DK, Hla T. Новый метод количественного определения сфингозин-1-фосфата с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC). Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2007; 84: 154–162. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

15. He X, Huang CL, Schuchman EH. Количественный анализ сфингозин-1-фосфата с помощью ВЭЖХ после дериватизации нафталин-2,3-дикарбоксальдегида (NDA). J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009; 877: 983–990. [PubMed] [Академия Google]

16. Мано Н., Ода Ю., Ямада К., Асакава Н., Катаяма К. Метод одновременного количественного определения метаболитов сфинголипидов с помощью жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии с ионизацией ионным распылением. Анальная биохимия. 1997; 244: 291–300. [PubMed] [Google Scholar]

17. Белявски Дж., Пирс Дж.С., Снайдер Дж., Рембиса Б., Шульц З.М., Белавска А. Комплексный количественный анализ биоактивных сфинголипидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Методы Мол Биол. 2009 г.;579:443–467. [PubMed] [Google Scholar]

18. Санчес Т., Хла Т. Структурные и функциональные характеристики рецепторов S1P. Джей Селл Биохим. 2004; 92: 913–922. [PubMed] [Google Scholar]

19. Liu CH, Thangada S, Lee MJ, Brocklyn JR, Spiegel S, Hla T. Лиганд-индуцированный перенос сфингозин-1-фосфатного рецептора EDG-1. Мол Биол Селл. 1999; 10:1179–1190. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

20. Okajima F, Sato K, Kimura T. Антиатерогенное действие липопротеинов высокой плотности через сфингозин-1-фосфатные рецепторы и рецепторы-мусорщики класса B типа I. Endocr J 2009 г.;56:317–334. [PubMed] [Google Scholar]

Протокол

— Протокол ИФА сэндвич

Протокол — Протокол ИФА сэндвич США

 

Реагенты

  • Карбонатный буфер для покрытия: BioLegend Кат. № 421701 или:
    8,4 г NaHCO 3
    3,56 г Na 2 CO 3
    Добавить ddH 2 O до 1,0 л pH до 9,5
  • Фосфатно-солевой буфер (PBS): BioLegend Cat. № 926201
  • PBS/Tween:
    0,5 мл Tween-20 на 1 л PBS
  • Блокирующее решение:
    10% фетальной бычьей сыворотки или 1% BSA в PBS.
    Фильтр перед использованием для удаления твердых частиц.
  • Решение для остановки TMB:
    БиоЛегенда Кот. № 423001 или 1M H 3 PO 4 или 2N H 2 SO 4
  • Раствор субстрата ABTS:
    150 мг диаммониевой соли 2,2′-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (Sigma, № по каталогу A-1888)
    Добавить к 500 мл 0,1М лимонной кислоты в ddH 2 О
    Отрегулируйте pH до 4,35 с помощью NaOH
    . Аликвоты по 11 мл на флакон и хранить при -20°C.
    Избегайте воздействия света во время приготовления и хранения.
  • Решение для остановки ABTS:
    Смешайте 50 мл диметилформамида (DMF; Pierce, № по каталогу 20672) с 50 мл ddH 2 O Добавьте 20 г додецилсульфата натрия
  • TMB (тетраметилбензидин) Набор реагентов субстрата: BioLegend Кат. № 421101

 

Шаги протокола

Покрытие планшета:

  1. Разбавьте немеченое захватывающее антитело до конечной концентрации 0,5–8 мкг/мл в буфере для покрытия (BioLegend, кат. 421701) и перенесите по 100 мкл в каждую лунку. планшета для высокоаффинного связывания белков ELISA (, например, , BioLegend, кат. № 423501).

  2. Уплотнительная пластина для предотвращения испарения. Инкубируйте при 4°C в течение ночи.

Блок пластины:

 

  1. Доведите планшет до комнатной температуры, стряхните раствор захватывающих антител, промойте 3 раза раствором PBS/Tween и заблокируйте сайты неспецифического связывания, добавив в каждую лунку 200 мкл блокирующего раствора.
    Примечание: Возможно, вам придется поэкспериментировать с различными блокирующими растворами, такими как желатин или молоко, чтобы найти тот, который даст вам самый низкий фоновый шум.

  2. Закройте планшет и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
  3. Промыть 3 раза PBS/Tween. Плотно промокните тарелку чистыми бумажными полотенцами.

 

Добавьте стандарты и образцы:

 

  1. Разбавьте стандарты и образцы до желаемых концентраций в блокирующем растворе (выполните разведения в полипропиленовых пробирках или планшетах) и добавьте 100 мкл на лунку планшета для ELISA.
    Примечание: Постарайтесь подобрать разбавитель стандартов как можно ближе к матрице в ваших образцах. Например, если вашими образцами являются супернатанты клеточных культур, используйте ту же среду для разбавления стандартов.

  2. Закройте планшет и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2–4 часов или при 4°C в течение ночи.

  3. Промыть 3 раза PBS/Tween. Промывки можно эффективно выполнять, заполняя лунки шприцем, бутылью, многоканальным дозатором, многоканальным пипетером или автоматическим промывателем планшетов. Для большей строгости после каждой промывки дайте планшету немного постоять, снимите буфер и промокните планшеты бумажными полотенцами перед повторным наполнением.
    Примечание: Очень важно использовать чистые бумажные полотенца после каждой стирки. Это поможет избежать любого возможного перекрестного загрязнения.

 

Добавить детектирующее антитело:

 

  1. Разведите детектирующее антитело, меченное биотином, до концентрации 0,25–2 мкг/мл в блокирующем растворе. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл разбавленного антитела.

  2. Закройте планшет и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.

  3. Промыть 3 раза PBS/Tween.

 

Добавьте авидин-пероксидазу хрена (Av-HRP):

 

  1. Разбавьте конъюгат Av-HRP (кат. № 405103) или конъюгат другого фермента до предварительно определенной оптимальной концентрации в блокировании Буфер (обычно между 1/500-1/2000). Добавьте по 100 мкл на лунку.

  2. Закройте планшет и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

  3. Промыть 5 раз PBS/Tween.

 

Добавить субстрат (ABTS для более медленного проявления цвета):

 

  1. Разморозить раствор субстрата ABTS в течение 20 минут после использования. Добавьте 11 мкл 30% H 2 O 2 на 11 мл субстрата и вортексе. Немедленно внесите по 100 мкл в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре (4–60 мин) для развития окраски. Чтобы остановить цветную реакцию, добавьте 50 мкл стоп-раствора ABTS.

  2. Измерьте оптическую плотность (ОП) для каждой лунки с помощью устройства для считывания микропланшетов, настроенного на 405 нм.

 

 

ИЛИ Добавьте субстрат (TMB для более быстрого проявления цвета):

 

  1. Для каждого планшета смешайте 6 мл реагента TMB A с 6 мл реагента TMB B (BioLegend TMB Substrate Набор реагентов, № по каталогу 421101) непосредственно перед использованием. Перенесите по 100 мкл в каждую лунку. Инкубируйте при комнатной температуре (4–30 мин) для развития окраски. Чтобы остановить цветную реакцию, добавьте 100 мкл стоп-раствора TMB.

  2. Измерьте оптическую плотность (ОП) для каждой лунки с помощью устройства для считывания микропланшетов, настроенного на 450 нм.

 

Cytokine ELISA Советы по устранению неполадок:

 

Растворы и буферы:

  • Не используйте азид натрия в каких-либо буферах или растворах, т.к. ide инактивирует фермент пероксидазу хрена.

Плохое отношение сигнал/шум :

  • Попробуйте захватить антитело в концентрации 1–10 мкг/мл (обычно 2 мкг/мл).
  • Пробное обнаружение антител в концентрации 0,25–2 мкг/мл (обычно 1 мкг/мл).
  • Титруйте друг против друга для получения оптимальных разведений.

Низкая чувствительность :

  • Попробуйте инкубировать стандарты и образцы в течение ночи при 4°C.

Плохой сигнал :

  • При использовании HRP избегайте азида натрия в промывочных буферах и разбавителях, поскольку азид натрия ингибирует HRP.
  • Убедитесь, что использовались соответствующие пары антител, а также активность образцов и/или стандартов.
  • Проверьте активность фермента и субстрата, покрыв детектирующим антителом (1 мкг/мл), добавив биотинилированный авидин и выявив соответствующий субстрат. Если фермент/субстрат активен, должен наблюдаться сильный сигнал.

Плохая стандартная кривая :

  • Инструкции по обращению со стандартами зависят от партии. Обратитесь к информации о продукте для правильного обращения.
  • Флаконы с рекомбинантным белком следует быстро вращать для максимального извлечения.
  • BioLegend предлагает хранить цитокины в концентрированном формате (100 нг/мл) и в присутствии белкового носителя.

Высокий фон :

  • Увеличьте жесткость этапов промывки, замачивая пластины примерно на 1 минуту во время промывки.