После того, как Криста Уорд нанесла удар, Грег Стюарт объявил о двойном перехвате. После того, как бросок снизился до второго, Мик оторвался от ворот с третьего и забил после того, как кэтчер был вызван за препятствие. ОИТ повел 2: 0 в нижней половине тайма.

Колледж Айдахо получил бы один обратно в третьем, но, кроме того, Сара Абрамсон показала хорошую подачу, и ее защита поддержала ее, когда это было необходимо. Несколько раз на протяжении игры туз Совы выбрасывал из строя пробки, которые могли бы сделать игру намного ближе.

Но, заняв первое место в пятой позиции, Oregon Tech воспользовалась парой ошибок Yotes и заработала две попытки.С преимуществом 4: 1 «Совы» использовали круиз-контроль и впервые за десять лет пробили свой билет на матч национального первенства.

«Честно говоря, это немного сюрреалистично — думать, что мы зашли так далеко, до этого момента», — сказал Басинджер NewsWatch 12 Sports после их победы. «Оглядываясь назад на февраль, когда мы начали, это было просто рукой, чтобы добраться до национального чемпионата, и теперь мы на самом деле здесь, и сейчас это действительно просто сюрреалистично.«

Oregon Tech ожидает команду, которая завтра выйдет из сетки проигравших, первая игра объединит Южный Орегон и Бетани в 13:00 по тихоокеанскому стандартному времени. В 16:00 по тихоокеанскому стандартному времени победитель этой игры встретится с Колледжем Айдахо, чтобы узнать, кто сыграет с «Совами» на национальном чемпионате.

AUSTOR Шлифовальные листы для деталей с мышью, 60 штук Подушечки для шлифования 12 отверстий Шлифовальная машина с крючками и петлями в ассортименте 60/80/120/180/240/320 зернистости, подходящая для Black and Decker Detail Принадлежности для ручных шлифовальных машин co Принадлежности для шлифовальных машин

AUSTOR Шлифовальные листы для деталей на 60 штук Подушечки для шлифовальных листов с 12 отверстиями Шлифовальная бумага с крючками и петлями в ассортименте 60/80/120/180/240/320 Зернистость, подходящая для шлифовальных листов Black and Decker

AUSTOR 60 шт. Шлифовальные листы для мышей Подушечки с 12 отверстиями Шлифовальная машина с крючками и петлями Наждачная бумага в ассортименте с зернистостью 60/80/120/180/240/320 для ручной шлифовальной машины Black and Decker Detail: Инструменты и предметы домашнего обихода. AUSTOR 60 шт. Шлифовальные листы для деталей с мышью Подушечки для шлифовальных листов с 12 отверстиями Шлифовальная машина с крючками и петлями Наждачная бумага в ассортименте 60/80/120/180/240/320 зерен, подходящая для шлифовальной машины Black and Decker для рук: инструменты и товары для дома. Практическая зернистость — включая 6 видов наждачной бумаги с разным зерном, от крупной до мелкой: 60 # 80 # 120 # 180 # 240 # 320 #, 10 листов для каждой зернистости, всего 60 листов, которые могут удовлетворить ваши требования для различных материалов и областей применения Технология подложки — шлифовальные листы на липучке, легко и быстро наклеиваются на шлифовальный станок。 Размер: размер наждачной бумаги для мыши размером около 135 * 95 мм, предварительно перфорированный с 12 отверстиями для удаления пыли, подходит для шлифовального станка 135 мм, пожалуйста, проверьте, есть ли нижняя пластина шлифовальной машины соответствует размеру шлифовальных тарелок или нет。 Высококачественный материал — шлифовальные листы AUSTOR изготовлены из абразивного материала на основе оксида алюминия, прочные и антистатические, чем крупнее зерно, тем лучше эффект полировки。 Широкое применение — мышь AUSTOR шлифовальные шкурки идеально подходят для удаления ржавчины, полировки металла, дерева, пластика, кожи, резины, стекла и т. д. Шлифовальные листы с деталями для мыши AUSTOR 60。 。Технические характеристики 。Абразив: оксид алюминия 。Размер: 135 * 95 мм 。Цвет: красновато-коричневый . Предварительно перфорированные с 12 отверстиями 。Технология задней части: липучка。 。Пакет включает шлифовальные листы 60 * 10 шлифовальных листов 。80 * 10 шлифовальных листов 。120 * 10 шлифовальных листов 180 * 10 шлифовальных листов 。240 * 10 шлифовальных листов 。320 * 10。。。

AUSTOR 60 штук Шлифовальные листы для мышей Подушечки с 12 отверстиями Шлифовальная машина с крючками и петлями в ассортименте 60/80/120/180/240/320 Зернистость, подходящая для ладонной шлифовальной машины Black and Decker

Античная латунь Маленькая zsjhtc Creative Lion Head Винтажные антикварные ручки для дверных ящиков шкафа с вытяжными кольцами, ручки, 2 шт. Бежевая осина Creative 30274-2 5 Ширина дна Переходный дизайн Маленькая люстра в форме колокольчика Набор абажуров 3 x 5 x 4.YG-1 E5522060 Твердосплавная концевая фреза Alu-Power, длинная спираль, 45 градусов, 6,0 мм, длина 57 мм, 2 зуба, без покрытия. CBB61 Run Capacitor 450V AC 1.5uF 2 Wire Металлизированные полипропиленовые пленочные конденсаторы 5 шт. 100 шт. В коробке Крепежные инновации 7300 Power-Stud-1/4-дюймовый на 1-3 / 4-дюймовый Расширительный анкер из нержавеющей стали 304 из нержавеющей стали, колода случайного цвета Настенный фонарь Baost на солнечной энергии Светодиодный настенный светильник Наружная дорожка Садовый забор Ландшафтная стена Лампа для передней двери гаража, 57Y02 Задние крышки для сварки TIG 57Y04 Короткие задние крышки Набор разного размера для сварочной горелки TIG WP-17/18/26 Средний 5pcs57Y02 (Длинный) Длинный 57Y03.Класс ограничения тока CC Отклоняющий картридж предохранители CCMR30 от Littelfuse 600V Midget Time Delay 10 PACK 30 Amp LITTELFUSE CCMR-30 или CCMR030 30A, ASR Outdoor плетеный веревка для выживания Technora 950 фунтов различной длины, натуральная, WallPops NU1661 Photo Opp Frames Peel and Stick Wallpaper Multi-Color. Symmons GIDDS-133963 Temptrol Diverter Volume Spindle TA-25A Белый. 22 мм 220V 10A Переключатель мгновенного действия Светодиодный переключатель сброса света с плоской головкой Зеленый кнопочный переключатель Вкл.

Роль Убенимекса при раке желудка.

Введение

Рак желудка (РЖ) — одна из самых распространенных опухолей желудочно-кишечного тракта. ¹ Международное агентство по изучению рака сообщило о примерно 19,3 миллионах новых случаев рака во всем мире в 2020 году и примерно 10 миллионах смертей. В Китае заболеваемость GC занимает четвертое место среди злокачественных опухолей, тогда как смертность от GC занимает второе место. Заболеваемость GC в Китае составляет почти половину всех случаев заболевания во всем мире, что серьезно угрожает жизни и здоровью людей. ² Начало GC незаметно, и ранние поражения ограничиваются слизистой и подслизистой оболочкой. ³ Таким образом, у большинства пациентов с РЖ диагностируется запущенная стадия, из которых 5-летняя выживаемость после операции составляет менее 30%. ⁴ Как и многие злокачественные новообразования, GC склонен к метастазированию в другие органы, такие как печень и легкие. ⁵ Чтобы снизить уровень смертности от ГК, необходимы новые методы ранней диагностики и новая таргетная терапия для предотвращения метастазов.

CD13, также называемая аминопептидазой N (APN), принадлежит к семейству мембранных металлопротеиназ типа II и экспрессируется на различных опухолевых клетках. CD13 использует протеолитические ферменты, способствующие васкуляризации, пролиферации, инфильтрации и метастазированию опухолевых клеток. ⁶ Нет подробных исследований прямого противоопухолевого эффекта Убенимекса, но появляются доказательства, указывающие на комбинированное применение с химиотерапевтическими препаратами. В частности, Убенимекс оказывает синергетическое действие с 5-фторурацилом и улучшает химиотерапевтический эффект 5-фторурацила в отношении рака печени, почек, рака груди и других опухолей. ⁷ Более того, Убенимекс способствует апоптозу, индуцированному химиотерапией, и ингибирует экспрессию транспортеров АТФ-зависимого белка-переносчика (ABC), тем самым обращая вспять множественную лекарственную устойчивость в клетках гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) путем воздействия на CD13. Однако, как единственный ингибитор CD13, представленный в настоящее время на рынке, Убенимекс используется только в качестве вспомогательного средства в сочетании с химиотерапией в качестве иммуномодулирующей терапии. ⁸ Нет сообщений о связи между экспрессией CD13 и метастазами GC, не говоря уже о ингибировании метастазов GC, опосредованном Убенимексом.

NGFI-A-связывающий белок 1 (NAB1) принадлежит к семейству NGFI-A / Egr-связывающих белков, ⁹ , которые действуют как корепрессоры для взаимодействия с Egr2 и необходимы для правильной координации образования миелина. ^10,11 Убедительные доказательства показали, что NAB1 взаимодействует с HIC-1, обеспечивая нормальную секрецию Wnt в качестве адаптера для множественных белков, чтобы взаимодействовать с F-actin, чтобы регулировать различные процессы в нервной системе. ¹² NAB1 также является корепрессором транскрипции, и ранее он был идентифицирован как ген, реагирующий на глюкокортикоиды, в гладкомышечных клетках хомячка, а также может быть корепрессором, влияющим на воспалительные реакции. ¹³ Однако мало сообщений об исследовании NAB1 в опухолях, и ни одно исследование не показало, что NAB1 участвует в ингибировании метастазирования GC.

Активированные митогеном протеинкиназы (MAPK) широко активируются во многих типах клеток, которые играют ключевую роль в стимулировании роста и метастазирования опухоли.Как сообщается, IDO1 и COL12A1 синергетически способствуют метастазированию GC, образуя петлю положительной обратной связи через путь MAPK и CXCR7, который рассматривался как хемокиновый рецептор для SDF-1. ¹⁴ Киназа, регулируемая внеклеточными сигналами (ERK), является основной киназой семейства MAPK, которая регулирует пролиферацию, апоптоз, дифференцировку и прогрессирование различных раковых клеток человека. Кроме того, инактивация пути MAPK / ERK снижает индуцированный SMARCE1 рост и подвижность GC-клеток. ¹⁵ Известно, что сигнальный путь MAPK играет роль в регуляции пролиферации, инвазии и метастазирования опухолей. ^16,17 Однако несколько исследований показали взаимосвязь между NAB1 и MAPK в клетках GC.

Здесь мы продемонстрировали, что Убенимекс ингибирует метастазирование GC путем подавления экспрессии CD13. Кроме того, мы провели скрининг с высоким содержанием (HCS) и обнаружили, что NAB1 является предполагаемой мишенью CD13, с помощью которой Убенимекс подавляет GC. Кроме того, Убенимекс может ингибировать метастазирование GC через путь CD13 / NAB1 / MAPK. В совокупности эти результаты показали, что Убенимекс является многообещающим агентом, который может ингибировать метастазирование GC.

Методы

Реактивы и антитела

Убенимекс (чистота ≥99,9%) был приобретен у Shenzhen Main Luck Pharmaceuticals Inc. (Шэньчжэнь, Китай), растворен в ДМСО и затем разбавлен стерилизованной средой Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM). Конечная концентрация ДМСО в культурах была <0,1%. Кроличьи моноклональные антитела против ANPEP (CD13; Abcam Biotechnology, Кембридж, США; каталожный номер ab108382; 1: 3000), NAB1 (Abcam; каталожный номер ab150389; 1: 3000), p ‑ MAPK (Abcam; кат.нет. ab151279; 1: 250), E-кадгерин (Elabscience Biotechnology Co., Ltd, Ухань, Китай; номер по каталогу E-AB-53267; 1: 1000), N-кадгерин (Elabscience; номер по каталогу E-AB-70061. ; 1: 1000), виментин (Elabscience; каталожный номер E-AB-18212; 1: 2000) и β-актин (Proteintech, Rosemont, IL, USA; каталожный номер 20536-1-AP; 1: 3000 ) были использованы в этом исследовании. Все вторичные антитела (каталожный номер SA00001-2; 1: 3000) были приобретены в Proteintech Biosciences.

Культура клеток

Линии клеток желудка человека (MKN-28, MGC-803, BGC-823 и SGC-7901) были приобретены в Банке клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и культивированы в среде DMEM (Гибко, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (North China Pharmaceutical Co. , Inc., Шицзячжуан, Китай) в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C.

Конструирование плазмид и амплификация генов

Плазмиды сверхэкспрессии NAB1 (номер в GenBank NM__001321313), меченные усиленным зеленым флуоресцентным белком (EGFP) (CD13; номер в GenBank NM_001150) и плазмиды отрицательного контроля (контрольная плазмида с пустым вектором; CMV-MCS-3FLAG-IRES-EGFP-SV40-SV40 ) были использованы в этом исследовании. Мы провели поиск кодирующей последовательности человеческого NAB1 в GenBank и разработали праймеры для ПЦР.Следующие пары праймеров были сконструированы на основе последовательностей мРНК ANPEP и NAB1: ANPEP-p1, 5ʹ-TACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCCAAGGGCTTCTATATTTCCAAG-3ʹ; ANPEP-p2, 5ʹ-TCCTTGTAGTCCATGGATCCTTTGCTGTTTTCTGTGAACCACTGGAGCAC-3ʹ; NAB1-p1, 5ʹ-TACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCTGCGGCCTTACCCAG-3ʹ; и NAB1-p2, 5ʹ-TCCTTGTAGTCCATGGATCCTCTTGAATCTTCAGGCTCTG-3ʹ. Последовательности праймеров для идентификации ПЦР были следующими: ANPEP-p3, 5ʹ-CAGTACATGCCCTGGGAGGC-3ʹ; ANPEP-p4, 5ʹ-AACGCACACCGGCCTTATTC-3ʹ; NAB1-p3, 5ʹ-CTCTGTGGCTGAGTGTGTGG-3ʹ; и NAB1-p4, 5ʹ-AACGCACACCGGCCTTATTC-3ʹ.Смесь для ПЦР содержала 2 мкл матрицы кДНК, 1 мкл праймера (10 мкмоль / л), 10 мкл смеси для ПЦР и dH ₂ O до общего объема 20 мкл. Программа ПЦР была следующей: 94 ° C в течение 5 мин; 40 циклов 94 ° C в течение 30 с, 58 ° C в течение 30 с и 72 ° C в течение 5 минут; и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 5 мин. Конечные продукты ПЦР разделяли электрофорезом с использованием 1% полиакриламидных гелей, а целевой фрагмент очищали и выделяли с использованием набора для экстракции из геля агарозы (Watson Biomedical Inc., Шанхай, Китай).

Трансфекция клеток

ANPEP (CD13) и NAB1 использовали для трансфекций клеток. Клетки MKN-28, MGC-803, BGC-823 и SGC-7901 высевали в 6-луночные планшеты для культивирования клеток и культивировали до 80% слияния. Затем добавляли реагент липофектамин 3000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) и клетки трансфицировали плазмидами в течение 24 часов при 37 ° C. Процедуры выполнялись в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ генных чипов и HCS функции клеток

Генный чип Affymetrix Clariom ^TM S использовали для определения спектра экспрессии генов клеток MKN-28 до и после обработки Убенимексом и оценки изменений в экспрессии генов.В этом исследовании скорость миграции клеток MKN-28 оценивалась с помощью скрининга высокого содержания (HCS). Более того, подвижность выбранных генов снижалась более чем в два раза, о чем ранее сообщалось в предыдущей литературе. Эффект подавления экспрессии CD13 на уровне мРНК вышеуказанных генов наблюдали в эксперименте с HCS, и был выбран важный ген с наиболее очевидным изменением экспрессии в процессе контроля метастазов GC.

Вестерн-блоттинг

Общий белок из клеток GC, обработанных Убенимексом, экстрагировали с использованием буфера для лизиса RIPA, содержащего фенилметансульфонилфторид (PMSF; Solarbio Biotechnology Co., Шанхай, Китай) и ингибитор протеинфосфатазы (Solarbio) после промывания клеток ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS). Концентрацию белка измеряли с помощью анализа белка BCA (Solarbio) после центрифугирования при 10000 об / мин в течение 8 минут. Равные количества белка разделяли на 10% полиакриламидных гелях SDS и затем переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA), которые затем блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 2 часов при комнатной температуре.Затем мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° C со следующими первичными антителами: анти-ANPEP, анти-фосфо-MAPK, анти-NAB1 и анти-β-актином. Затем мембраны трижды промывали трис-буферным физиологическим раствором-твином (TBST, Solarbio) и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Bio-Rad Quantity One v4.62 (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.). Все анализы вестерн-блоттинга выполнялись не менее трех раз.Значения оттенков серого целевых полос анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH Image, Bethesda, MD, США).

Анализаторы Transwell

Способность культивированных клеток к миграции и инвазии оценивали с использованием трансвелл-камеры (8 мм, 24-луночный формат; Corning) с разбавленным матригелем или без него (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния). Смесь 1: 8 матригель: DMEM (40 мкл) добавляли в верхнюю камеру при 37 ° C в течение 1 часа. Затем в верхнюю камеру добавляли Убенимекс (0,12 мг / мл) и клетки GC (3 × 10 ⁵ клеток / мл), которым не хватало сыворотки в течение 10 часов.Среду с добавлением 20% FBS помещали в нижнюю камеру. После инкубации при 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 24 часов клетки, оставшиеся на верхней поверхности мембраны, осторожно протирали ватным тампоном, а нижнюю камеру трижды промывали PBS. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 1 часа, а затем окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 40 минут. Количество мигрировавших клеток фотографировали и подсчитывали.

Анализы заживления ран

Анализ заживления ран использовали для определения способности клеток желудка к миграции.Клетки (5 × 10 ⁵ клеток на лунку) добавляли в 6-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи до 100% конфлюэнтности. На пластинах наносили царапину с помощью пипетки на 10 мкл. Клетки дважды промывали PBS, а затем в планшеты добавляли полную среду и 0,12 мг / мл или 0,25 мг / мл Убенимекса. Затем клетки инкубировали при 37 ° C в атмосфере с 5% CO ₂ в течение определенного времени. Впоследствии были получены изображения и измерена площадь заживления.

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с помощью GraphPad Prism 7.0 (Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение или стандартная ошибка среднего, и они были оценены с помощью одностороннего дисперсионного анализа. Различия считались достоверными при P <0,05. Статистически значимые значения P были представлены как * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001. Эксперименты были выполнены в трех повторностях и независимо, и данные были представлены в трех повторностях из одного независимого эксперимента.

Результаты

Убенимекс значительно ограничивает миграцию и потенциал инвазии клеток GC

Во-первых, был проведен анализ заживления ран, чтобы определить, подавляет ли Убенимекс метастазы GC.Как показано на рис. 1A – F, Убенимекс подавлял способность к миграции клеток GC, и ингибирующий эффект варьировал при различных концентрациях (рис. 1A – F). Кроме того, результаты, полученные в ходе трансвеллентных анализов, подтвердили, что по сравнению с контрольной группой количество инвазированных и мигрирующих клеток GC, обработанных Убенимексом, было уменьшено (рис. 1G и I). Наши результаты показали, что Убенимекс ослабляет инвазионный и миграционный потенциал клеток MKN-28, MGC-803, BGC-823 и SGC-7901, а способность Убенимекса ослаблять метастазы GC увеличивалась с увеличением концентрации лекарственного средства (рис. 1H и J).После обработки клеток GC с различными концентрациями Ubenimex и экстракции белка использовали анализ вестерн-блоттинга для идентификации экспрессии белка EMT-маркеров в различных линиях клеток GC. В соответствии со сниженной экспрессией N-кадгерина, экспрессия белка виментина, определенная с помощью Вестерн-блоттинга, была заметно ниже в клетках GC, обработанных Убенимексом, чем в клетках контрольной группы. Однако экспрессия E-cadherin в клетках GC постепенно увеличивалась с увеличением концентрации Ubenimex (Рисунок 1K – N).В совокупности эти данные показали, что Убенимекс значительно ограничивает миграцию и инвазионный потенциал клеток GC.

Убенимекс ингибирует проникновение и миграцию клеток GC, в которых снижение CD13 имеет важное значение

Чтобы проверить основной механизм, в котором Убенимекс ингибирует миграцию и инвазию клеток желудка, мы оценили экспрессию белка CD13 с помощью Вестерн-блоттинга. Как и ожидалось, экспрессия белка CD13 демонстрировала различную степень снижения после обработки Убенимексом (рис. 2А и В).Кроме того, был проведен анализ трансвеллеров, чтобы определить, ингибирует ли Убенимекс инвазию и миграцию клеток GC за счет снижения экспрессии CD13. Как показано на Рисунке 2, количество инвазивных и мигрирующих клеток после трансфекции плазмиды сверхэкспрессии CD13 было меньше, чем у контрольной группы, но больше, чем у группы Ubenimex (Рисунок 2C-F). Таким образом, мы можем сделать вывод, что ингибирующая способность к инвазии и миграции GC, опосредованная Ubenimex, была компенсирована после сверхэкспрессии CD13.Эти результаты свидетельствуют о том, что Убенимекс подавляет способность к инвазии и миграции GC-клеток, в которых необходимо снижение CD13.

Скрининг генного чипа и идентификация гена-мишени, ассоциированного с метастазами, опосредованными убенимексом, в GC

Для получения гена-мишени, связанного с метастазами GC, мы использовали генный чип Affymetrix Clariom ^TM S для идентификации профиля экспрессии гена в клетках MKN-28 после обработки Убенимексом. Данные показали, что убенимекс подавлял и усиливал несколько генов (рис. 3А). Были отобраны предполагаемые гены, которые были подавлены более чем в два раза, и эти гены могут быть сильной силой, запускающей метастазирование опухоли (рис. 3B).Эти гены были обогащены сигнальными путями и отобраны для скрининга с высоким содержанием. Оценка изменений скорости миграции клеток MKN-28 после подавления родственных генов показала, что 25 генов играют важную роль в опосредованном Убенимексом ингибировании метастазов GC. Важно отметить, что NAB1 продемонстрировал наиболее значительное подавление, которое представляет собой инициатор зла в продвижении метастазов GC (рис. 3C и D). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что Убенимекс подавлял метастазирование GC, воздействуя на CD13, в котором подавление NAB1 также было важным.

NAB1 — предполагаемая сигнальная молекула нисходящего потока CD13

Для изучения взаимосвязи между CD13 и NAB1 уровни экспрессии белка после трансфекции плазмиды со сверхэкспрессией CD13 или NAB1 измеряли с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на фиг. 4A – D, экспрессия NAB1 увеличивалась после сверхэкспрессии CD13, однако отчетливого изменения в экспрессии CD13 после сверхэкспрессии NAB1 не наблюдается. Эти данные свидетельствуют о том, что CD13 способствует экспрессии белка NAB1 в одном направлении.Кроме того, анализы вестерн-блоттинга подтвердили, что экспрессия NAB1 снижалась в клетках GC с помощью Ubenimex в различных концентрациях. Эти данные указывают на то, что NAB1 является предполагаемой мишенью ниже CD13 (фиг. 4E и F). Кроме того, Убенимекс ингибирует экспрессию NAB1, которая зависит от подавления экспрессии CD13, предполагая, что NAB1 является ключевой молекулой, с помощью которой Убенимекс регулирует экспрессию CD13 и ингибирует метастазирование клеток GC.

Убенимекс ингибирует метастазирование ГК, облегчая активацию сигнального пути CD13 / NAB1 / MAPK

Растущее количество доказательств предполагает, что сигнальные пути NAB1 и MAPK связаны с онкогенезом, пролиферацией и метастазированием. ¹⁸ Чтобы определить, участвует ли инактивация сигнального пути MAPK в опосредованном Убенимексом ингибировании метастазов GC, экспрессия фосфорилированной MAPK (p-MAPK) в клетках GC после обработки Убенимексом была обнаружена с помощью Вестерн-блоттинга.Значения в градациях серого для p90RSK, ERK1 / 2, RPS6 и Rab11 были значительно снижены с увеличением концентрации Убенимекса, предполагая, что смягченная активация сигнального пути MAPK участвует в подавлении метастазов, опосредованном Убенимексом (Рисунок 5A – D). Для дальнейшего изучения того, как Ubenimex проявляет этот эффект, воздействуя на CD13, тем самым влияя на активность NAB1 и регулируя активацию сигнального пути MAPK, плазмиды сверхэкспрессии NAB1 трансфицировали в клетки GC.По сравнению с группой, получавшей убенимекс, уровни экспрессии белков p90RSK, ERK1 / 2, RPS6 и Rab1 в группе плазмиды со сверхэкспрессией NAB1 были значительно выше. Таким образом, Убенимекс не только подавляет экспрессию NAB1, нацеливаясь на CD13, но также подавляет метастазирование GC, регулируя сигнальный путь MAPK (рис. 5E – H). Кроме того, в анализах миграции и инвазии через лунки высокая экспрессия NAB1 значительно увеличивала способность GC-клеток к миграции и инвазии по сравнению с GC-клетками, обработанными Убенимексом.(Рисунок 5I – L). Эти результаты показали, что Убенимекс ингибировал пролиферацию, миграцию и инвазию клеток GC посредством активации пути передачи сигнала CD13 / NAB1 / MAPK.

Обсуждение

Как известно, Убенимекс играет роль в усилении иммунной функции, в основном в ответ на химиотерапию и адъювантную лучевую терапию, а также при возрастном иммунодефиците. ¹⁹ Убенимекс можно использовать с химиотерапией, лучевой терапией или с обоими методами лечения лейкемии, множественной миеломы, синдрома костного мозга, трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и солидных опухолей. ²⁰ Однако в нескольких исследованиях сообщалось, что он имеет функции по подавлению метастазов в желудке. CD13 был впервые охарактеризован как поверхностный маркер для гемопоэтических клеток миелоидного происхождения, ^21,22 , и он экспрессируется в различных типах клеток, таких как эпителиальные клетки, нервные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки. ²³ Примечательно, что CD13 сверхэкспрессируется в клетках острого миелоидного лейкоза и множественных солидных опухолях, включая рак легких, рак толстой кишки и рак яичников, вызывая пролиферацию опухоли и подавляя апоптоз, а также усиливая клеточную агрессию и васкуляризацию. ²⁴ Растущее число исследований продемонстрировало, что ингибиторы CD13 улучшают эффективность химиотерапии. Однако ни одно исследование не показало влияние Убенимекса в сдерживании метастазов ГК посредством нацеливания на CD13. Здесь мы продемонстрировали, что Убенимекс влияет на миграцию и инвазионную способность клеток GC, чтобы ингибировать метастазирование GC. По сравнению с контрольной группой Убенимекс снижал экспрессию белка CD13 и миграцию клеток GC после трансфекции плазмид со сверхэкспрессией CD13.

В этом исследовании для выявления гена, связанного с подавлением метастазов GC, опосредованным убенимексом, были использованы технология генных чипов и скрининг с высоким содержанием, и NAB1 был идентифицирован как предполагаемый ген-мишень. Фактор роста нервов (NGF1) -A-связывающий белок (NAB1), также известный как zif268, Egr1 и Krox-24, представляет собой фактор транскрипции цинкового пальца. ²⁵ NAB1 связан с транскрипцией факторов транскрипции семейства Egr Egr1 (Krox-24), Egr2 (Krox-20) и Egr3 (PILOT). ⁹ NAB1 способствует развитию задней части мозга путем регулирования генов, связанных с оболочкой спинномозговых нервов, в шванновских клетках. Одно исследование показало, что NAB1 представляет собой фактор ингибирования транскрипции, который ингибирует отложение жира в миокарде, и его экспрессия подавляет прогрессирование патологического ожирения, но способствует росту и развитию мышечных клеток. ²⁶ NAB1 кодируется в ответ на различные внеклеточные стимуляторы, ²⁷ включая пролиферацию клеток, дифференцировку макрофагов, синаптическую активацию и усиление дальнего действия.В настоящем исследовании мы изучили механизм NAB1 как важной молекулы в опухолях, и мы исследовали связанные с ним сигнальные пути. Наше исследование показало, что Убенимекс, который широко используется в клиниках для иммуносупрессии, регулирует NAB1, воздействуя на CD13, тем самым влияя на метастазирование GC. В литературе мало сообщений о метастазах NAB1 и GC. Наше исследование выявило новую область исследований с участием NAB1 в GC.

MAPK принадлежат к семейству серин-треониновых киназ, которые широко экспрессируются в различных клетках в виде следующих трех основных подсемейств: киназы, регулируемые внеклеточными сигналами (ERK MAPK, Ras, Raf1, MEK и ERK), N-концевые киназы c-Jun или активируемые стрессом протеинкиназы (JNK или SAPK) и MAPK14. ^28,29 Растущее число исследований продемонстрировало, что пути передачи сигналов MAPK, включая киназы JNK, ERK и p38, ^30,31 играют решающую роль в пролиферации, инвазии и миграции раковых клеток. Некоторые исследования показали, что ERK является основной киназой семейства MAPK, а ERK играет решающую роль в стимулировании пролиферации, апоптоза, дифференцировки и роста клеток. ^32,33 ERK активируется различными онкогенами и внеклеточными стимулами. Недавние исследования также показали, что пути ERK и MAPK имеют решающее значение для пролиферации и миграции клеток GC. ³⁴ Эффекты инфекции Helicobacter pylori , экспрессия гепараназы (HPA) и белка MAPK в GC были проанализированы путем изучения ассоциаций между клиническими патологическими характеристиками GC и вышеуказанными факторами. ³⁵ Как положительная экспрессия HPA, так и положительная экспрессия MAPK связаны с глубиной инвазии. ³⁶ Многие исследования изучали участие p-38 и JNK в пути передачи сигналов MAPK, подтверждая, что путь, исследуемый в настоящем исследовании, связан с MAPK. ^37–39 Однако в нашем исследовании изменения четырех молекул (p90RSK, ERK1 / 2, RPS6 и Rab11) продемонстрировали, что Ubenimex регулирует путь передачи сигналов MAPK. Это исследование предполагает, что Убенимекс ингибирует метастазирование GC, воздействуя на CD13 и дополнительно регулируя путь MAPK. Результаты экспериментов предоставили новые идеи и потенциальные новые приложения для Ubenimex в будущем.

Таким образом, настоящее исследование продемонстрировало, что Убенимекс подавляет рост линий GC-клеток человека MGC-803, SGC-7901, BGC-823 и MKN-28 in vitro.Убенимекс подавляет инвазию, миграцию и метастазирование человеческих GC-клеток, воздействуя на CD13 и активируя сигнальный путь MAPK. Кроме того, Убенимекс регулирует активность NAB1, выявляя корреляцию между белками сигнального пути CD13, NAB1 и MAPK. Таким образом, наше исследование подтверждает потенциальную терапевтическую ценность Убенимекса в подавлении метастазирования GC-клеток человека MGC-803, SGC-7901, BGC-823 и MKN-28, указывая на новое применение Убенимекса, тем самым обеспечивая новую основу для дальнейших научных исследований. исследовать.

Сокращения

GC, рак желудка; Убэ, Убенимекс; APN, аминопептидаза N; NAB1, связывающий белок 1 NGFI-A; JNK, Jun N-терминальная киназа; ERK, внеклеточные регулируемые протеинкиназы; MAPK, митоген-активированная протеинкиназа.

Заявление об обмене данными

Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Благодарности

Работа поддержана Фондом естественных наук провинции Шаньдун, Китай (ZR2017MH045).Мы все благодарим экспертов American Journal за языковое редактирование.

Авторские взносы

Все авторы внесли значительный вклад в описанную работу, будь то концепция, дизайн исследования, выполнение, сбор данных, анализ и интерпретация, или во всех этих областях; принимал участие в написании, редактировании или критическом рецензировании статьи; дал окончательное одобрение версии, которая будет опубликована; договорились о журнале, в который была подана статья; и соглашаемся нести ответственность за все аспекты работы.

Раскрытие информации

Авторы заявили об отсутствии потенциального конфликта интересов в этой работе.

Список литературы

1. Fock KM. Обзорная статья: эпидемиология и профилактика рака желудка. Алимент Фармакол Тер . 2014. 40 (3): 250–260. DOI: 10.1111 / apt.12814

2. Бьянка Б., Мейер TF. Возбудитель желудочного заболевания человека хеликобактер пилори и его связь с раком желудка и язвенной болезнью. Язвы . 2011; 2011: 1–23. DOI: 10.1155 / 2011/340157

3.Хушалани Н.И. Рак пищевода и желудка. Практикующий . 2008. 83 (6): 712–722. DOI: 10.1016 / S0025-6196 (11) 60900-2

4. Руань Т., Лю В., Тао К., Ву, Калифорния. Обзор результатов исследований механизмов множественной лекарственной устойчивости при раке желудка. Онко Мишеники . 2020; 13: 1797–1807. DOI: 10.2147 / OTT.S239336

5. июн SY, Park JK. Метахронные метастазы в яичники после резекции первичного рака желудка. J Рак желудка . 2011; 11 (1): 31–37.DOI: 10.5230 / jgc.2011.11.1.31

6. Гусман-Рохас Л., Рангель Р., Саламе А. и др. Совместные эффекты аминопептидазы N (CD13), экспрессируемой доброкачественными и раковыми клетками в микроокружении опухоли. Proc Natl Acad Sci U S A . 2012; 109 (5): 1637–1642. DOI: 10.1073 / pnas.11207

7. Хайли М.С., Парнис Ф.Х., Троттер Г.А. и др. Комбинированная химиотерапия с эпирубицином, цисплатином и 5-фторурацилом для паллиативного лечения распространенной аденокарциномы желудка и пищевода. Br J Surg . 1994. 81 (12): 1763–1765. DOI: 10.1002 / bjs.1800811218

8. Ямадзаки Т., Сугияма К., Итихара К. Влияние убенимекса на иммунную систему пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями. Биомед Фармакотер . 1991. 45 (2–3): 105–112. DOI: 10.1016 / 0753-3322 (91)-h

9. Свирнофф А.Х., Апель Э.Д., Сварен Дж. И др. Nab1, корепрессор NGFI-A (Egr-1), содержит активный домен репрессии транскрипции. Молекулярная биология . 1998. 18 (1): 512–524.DOI: 10.1128 / mcb.18.1.512

10. ЛаВалли Дж., Грант Т., Д’Анджело-Ранний С. и др. Уточнение сигнала ядерной локализации в корегуляторе транскрипции Egr NAB2. FEBS Lett . 2019; 593 (1): 107–118. DOI: 10.1002 / 1873-3468.13288

11. Zhao L, Yuan Y, Li P, et al. miR-221-3p ингибирует миелинизацию шванновских клеток. Неврология . 2018; 379: 239–245. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2018.03.019

12. Тикияни В., Ли Л., Шарма П., Лю Х., Ху З., Бабу К. Секреция Wnt регулируется тетраспановым белком HIC-1 через его взаимодействие с нейрабином / NAB-1. Cell Rep . 2018; 25 (7): 1856–1871.e6. DOI: 10.1016 / j.celrep.2018.10.053

13. Qiu FH, Devchand PR, Wada K, Serhan CN. Липоксин A4 и липоксин A4, запускаемый аспирином, активируют корепрессор транскрипции NAB1 в нейтрофилах человека. FASEB J . 2001. 15 (14): 2736–2738. DOI: 10.1096 / fj.01-0576fje

14. Xiang Z, Li J, Song S, et al. Положительная обратная связь между метаболитом IDO1 и COL12A1 через путь MAPK способствует метастазированию рака желудка. J Exp Clin Cancer Res .2019; 38 (1): 314. DOI: 10.1186 / s13046-019-1318-5

15. Лю Х., Чжао Ю.Р., Чен Б., Гэ З., Хуанг Дж. Высокая экспрессия SMARCE1 предсказывает плохой прогноз и способствует росту клеток и метастазированию при раке желудка. Cancer Manag Res . 2019; 11: 3493–3509. DOI: 10.2147 / CMAR.S195137

16. Вонг Д., Кандагатла П., Корз В., Чинни С.Р. Нацеливание на CXCR4 с помощью CTCE-9908 подавляет метастазирование опухоли простаты. БМК Урол . 2014; 14 (1): 12. DOI: 10.1186 / 1471-2490-14-12

17.Kobayashi H, Suzuki M, Kanayama N, Terao T. Генетическое подавление фосфоинозитид-3-киназы бикунином коррелирует с подавлением инвазии и метастазирования в HRA-клетках рака яичников человека. Дж. Биол. Хим. . 2004. 279 (8): 6371–6379. DOI: 10.1074 / jbc.M305749200

18. Косла Дж., Дворакова М., Дворак М., Чермак В. Эффективная дедифференцировка миофибробластов путем одновременного ингибирования передачи сигналов TGF-β и нарушения передачи сигналов MAPK. Eur J Cell Biol . 2013. 92 (12): 363–373.DOI: 10.1016 / j.ejcb.2013.10.013

19. Сакурая М., Тамура Дж., Ито К., Кубота К., Нарус Т. Ингибитор аминопептидазы убенимекс подавляет рост лейкемических клеточных линий и миеломных клеток за счет своей цитотоксичности. J Int Med Res . 2000. 28 (5): 214–221. DOI: 10.1177 / 147323000002800503

20. Урабе А., Муто Й., Мизогучи Х., Такаку Ф., Огава Н. Убенимекс в лечении острого нелимфоцитарного лейкоза у взрослых. Энн Гематол . 1993. 67 (2): 63–66. DOI: 10.1007 / BF01788128

21.Риман Д., Келен А., Лангнер Дж. CD13 — не только маркер при типировании лейкемии. Иммунол Сегодня . 1999. 20 (2): 83–88. DOI: 10.1016 / s0167-5699 (98) 01398-x

22. Харагути Н., Исии Х., Мимори К. и др. CD13 является терапевтической мишенью в стволовых клетках рака печени человека. Дж. Клин Инвест . 2010. 120 (9): 3326–3339. DOI: 10.1172 / JCI42550

23. Сайки И., Фуджи Х., Йонеда Дж. И др. Роль аминопептидазы N (CD13) в инвазии опухолевых клеток и деградации внеклеточного матрикса. Инт Дж. Рак .1993. 54 (1): 137–143. DOI: 10.1002 / ijc.2

24. Pang L, Zhang N, Xia Y, Wang D, Wang G, Meng X. APN / CD13 в сыворотке как новый диагностический и прогностический биомаркер рака поджелудочной железы. Онкотоваргет . 2016; 7 (47): 77854–77864. DOI: 10.18632 / oncotarget.12835

25. Руссо М.В., Севетсон Б.Р., Милбрандт Дж. Идентификация NAB1, репрессора транскрипции, опосредованной NGFI-A и Krox20. Proc Natl Acad Sci U S A . 1995. 92 (15): 6873–6877. DOI: 10.1073 / pnas.92.15.6873

26.Сагрилло К.А., Селманов М. Влияние пролактина на экспрессию мРНК, кодирующих немедленные ранние гены zif / 268 (NGF1-A), nur / 77 (NGF1-B), c-fos и c-jun в гипоталамусе. Brain Res Mol Brain Res . 1998. 61 (1–2): 62–68. DOI: 10.1016 / s0169-328x (98) 00198-3

27. Моринобу С., Страусбо Х., Тервиллигер Р., Думан Р.С. Регулирование c-Fos и NGF1-A при лечении антидепрессантами. Синапс . 1997. 25 (4): 313–320. DOI: 10.1002 / (SICI) 1098-2396 (199704) 25: 4 <313 :: AID-SYN1> 3.0.CO; 2-D

28. Fang JY, Ричардсон, Британская Колумбия. Сигнальные пути MAPK и колоректальный рак. Ланцет Онкол . 2005. 6 (5): 322–327. DOI: 10.1016 / S1470-2045 (05) 70168-6

29. Кириакис Дж. М., Аврух Дж. Пути передачи сигнала MAPK млекопитающих, активируемые стрессом и воспалением: 10-летнее обновление. Physiol Ред. . 2012. 92 (2): 689–737. DOI: 10.1152 / Physrev.00028.2011

30. Hsieh YY, Shen CH, Huang WS, et al. Резистин-индуцированная экспрессия фактора-1, происходящего из стромальных клеток, через toll-подобный рецептор 4 и активация сигнального пути p38 MAPK / NFκB в клетках рака желудка. Дж. Биомед. Наука . 2014; 21 (1): 59. DOI: 10.1186 / 1423-0127-21-59

31. Дик М., Клифтон А.Д., Лукок Л.М., Алесси Д.Р. Активированная митогеном и стрессом протеинкиназа-1 (MSK1) напрямую активируется MAPK и SAPK2 / p38 и может опосредовать активацию CREB. EMBO J . 1998. 17 (15): 4426–4441. DOI: 10.1093 / emboj / 17.15.4426

32. Wei L, Li Y, Suo Z. TSPAN8 способствует росту и метастазированию рака желудка через путь ERK MAPK. Int J Clin Exp Med . 2015; 8 (6): 8599–8607.

33. Сегер Р., Кребс Э.Г. Сигнальный каскад MAPK. FASEB J . 1995. 9 (9): 726–735. DOI: 10.1096 / fasebj.9.9.7601337

34. Roux PP, Blenis J. ERK и p38 MAPK-активированные протеинкиназы: семейство протеинкиназ с различными биологическими функциями. Microbiol Mol Biol Rev . 2004. 68 (2): 320–344. DOI: 10.1128 / MMBR.68.2.320-344.2004

35. Лю Л.П., Шэн ХР, Шуай Т.К., Чжао YX, Ли Б., Ли Ю.М. Helicobacter pylori способствует инвазии и метастазированию рака желудка за счет увеличения экспрессии гепараназы. Мир Дж. Гастроэнтерол . 2018; 24 (40): 4565–4577. DOI: 10.3748 / wjg.v24.i40.4565

36. Бонни А., Брюнет А., Вест А. Е., Датта С. Р., Такасу М. А., Гринберг М. Е.. Выживанию клеток способствует сигнальный путь Ras-MAPK с помощью транскрипционно-зависимых и независимых механизмов. Наука . 1999. 286 (5443): 1358–1362. DOI: 10.1126 / science.286.5443.1358

37. Xing J, Ginty DD, Greenberg ME. Связывание пути RAS-MAPK с активацией гена RSK2, киназой CREB, регулируемой фактором роста. Наука . 1996. 273 (5277): 959–963. DOI: 10.1126 / science.273.5277.959

38. Карраседо А., Ма Л., Теруя-Фельдштейн Дж. И др. Ингибирование mTORC1 приводит к активации пути MAPK через PI3K-зависимую петлю обратной связи при раке человека. Дж. Клин Инвест . 2008. 118 (9): 3065–3074. DOI: 10.1172 / JCI34739

39. Song YX, Yue ZY, Wang ZN, et al. МикроРНК-148b часто подавляется при раке желудка и действует как супрессор опухолей, ингибируя пролиферацию клеток. Молочный рак . 2011; 10 (1): 1. DOI: 10.1186 / 1476-4598-10-

Катод смещен 6v6