Расшифровка фбс блоки: Расшифровка ФБС — правильный вариант

Содержание

вес, размеры и цена в Москве

Маркировка изделия

Согласно ГОСТ 13579-78 название «ФБС 24.6.6-Т» расшифровывается следующим образом:

  • ФБС — фундаментный блок сплошной
  • 24 (первая цифра) — длина блока в метрах
  • 6 (вторая цифра) — ширина блока в метрах
  • 6 (третья цифра) — высота блока в метрах
  • Т — тяжелый бетон. Если эта маркировка в названии отсутствует, то фундаментный блок выполнен из других видов бетона, информация о котором указана в техническом паспорте на изделие

Все изделия ФБС, выпускаемые компанией «Евроконтракт», снабжаются техническим паспортом, содержащим следующий минимум информации:

  • дата изготовления ФБС;
  • ГОСТ
  • Морозостойкость и водонепроницаемость бетона;
  • Прочность и плотность бетона;

Блок ФБС 24.6.6

Фундаментные блоки ФБС 24.6.6 — высокопрочный материал, изготавливаемый из тяжелого бетона марки М100 и плотностью не менее 2300 кг/м3.

Широко используются в малоэтажном строительстве, в возведении промышленных зданий (склады, небольшие производственные помещения), в сооружении подвалов, а также для ограждения территории и создания искусственных преград в дорожном строительстве.

Основная задача, которую решают блоки ФБС 24.6.6 — равномерное распределение нагрузки здания на грунт. Они широко используются при закладке ленточного фундамента домов с монолитными стенами, с цокольным этажом или подвалов. Блоки ФБС 24.6.6 хорошо подходят для укладки в сильно пучинистые и влагонасыщенные грунты, где наиболее вероятна неравномерная осадка фундамента из-за неравномерности грунта или после оттаивания земли в весенний период. Ленточный фундамент в таких случаях срабатывает как единое целое и перераспределяют нагрузку стен, не допуская образования трещин или их обвала. Для обеспечения полной гидроизоляции фундамент покрывают битумом.

Преграда в дорожном строительстве

Возведение цокольного этажа

Блоки ФБС 24. 6.6 обладают высокими техническими характеристиками, хорошо подходящими для климатической зоны Москвы и Подмосковья. Они отличаются морозо- и влагостойкостью. Они прекрасно выдерживают температурые перепады от -70 оС до + 50oC. Отдельно стоит отметить, что блоки ФБС не токсичны и не крошатся при активном воздействии агрессивных сред. Допускается использование в сейсмоактивных регионах, где землетрясения достигают не более 8 баллов.

Доставка и хранение

Купить ФБС 24.6.6 можно напрямую с завода компании «Евроконтракт», расположенного в пределах Третьего транспортного кольца г.Москвы. Вы можете забрать их самостоятельно, либо воспользоваться услугами нашего специализированного автотранспорта. Доставка зачастую осуществляется в день заказа!

Хранить ФБС необходимо штабелями, плотно подгоняя каждое изделие друг у другу. Между блоками устанавливаются деревянные прокладки (не менее 30 мм шириной). При транспортировки изделия необходимо плотно фиксировать, исключив любую возможность их смещения относительно друг друга.

Контроль качества

Сформированная за 10 лет работы материально-техническая база позволяет компании «Евроконтракт» проводить лабораторные исследования производимой продукции на постоянной основе. Мы гарантируем, что вся наша продукция сертифицирована и соответствует не только российским, но и международным стандартам качества.

Блоки ФБС перед реализацию проходят две стадии контроля. Во-первых, это контроль качества бетона. Не допускаются к реализации блоки с поверхностными трещинами более 0,3 мм, имеющие углубления и наплывы, превышающие 15 мм. Отдельно бетон проверяется по четырем базовым параметрам, которые указываются в техническом паспорте:

Во-вторых, это проверка геометрии готового изделия. По длине допустимы изменения ±13 мм, по ширине и высоте — ±8 мм, а отклонения от прямолинейности профиля поверхностей ФБС — не более 3 мм на всю длину ширину блока.

Цена ФБС 24.6.6

 

Испытания прочности

Испытание морозойстойкости

Испытание водонепроницаемости

Испытание Воздухововлечение

 

Блоки ФБС — расшифровка, вес, фото, характеристики

Блоки ФБС расшифровка, вес, фото, характеристики.

Как правильно выбрать фундамент для конструкции и что такое ФБС в строительстве? Этот вопрос волнует каждого застройщика, ведь качественное основание для помещения любого типа стоит немало денег и занимает значительную часть в общей смете. Но если сэкономить на фундаменте, то вся конструкция подвергается риску.

Как получить надежное основание для конструкции, но при этом сэкономить средства.

Блоки ФБС, фото которых размещены на нашем сайте это идеальный вариант для прочного и надежного фундамента.

Что такое ФБС в строительстве.

Блоки ФБС (расшифровка – фундаментные блоки сплошные) – это лучший вариант для таких конструкций, как коттеджи, гаражи, фермы и другие небольшие сооружения, которые не требуют значительных материальных и трудовых затрат.

Какими преимуществами обладают эти железобетонные изделия.

При использовании в строительстве блоков ФБС значительно сокращается срок работы. Это происходит благодаря тому, что эти изделия не нуждаются в выдержке, как например, монолитные ленточные фундаменты. Такие блоки идеально подойдут для строительства в теплые времена года. Больше не нужно ждать целый месяц, чтобы фундамент полностью высох.

Благодаря специальным присадкам, что добавляются при изготовлении изделия, блоки ФБС (расшифровка фундаментные блоки сплошные) обладают отличной морозостойкостью и устойчивостью к агрессивной среде, например, к резким перепадам температуры в течение суток.

Большой выбор моделей. Блоки изготавливаются на заводах, которые специализируются на производстве железобетонных конструкций. Создать такие блоки самостоятельно невозможно. Это связано с тем, что завод – изготовитель использует специальную технологию (вибропрессование), соблюдая все необходимые требования к конструкции.

Реализовать такой способ возможно только в заводских условиях. Производители предлагают огромный выбор блоков.

Огромный модельный ряд удовлетворит каждого покупателя, который ищет материалы, которые подойдут именно для его стройки в соответствии с проектом.

Несмотря на большое количество преимуществ, необходимо помнить, что для укладки таких изделий вам понадобится спецтехника, потому что ФБС, вес имеет очень приличный.

Размеры ФБС.

Габариты ФБС (расшифровка – фундаментные блоки сплошные) закрепляют государственные нормативные документы. ГОСТ устанавливает длину, ширину, высоту, ФБС вес, а также допустимые отклонения от указанных величин.

Кроме стандартных габаритов, заводы изготавливают изделия по стандартам разных отраслей. Это позволяет строить фундаменты для различных помещений, несмотря на их размеры.

Монтаж и устройство блоков ФБС.

Блоки ФБС нельзя устанавливать на грунт по той причине, что их невозможно будет выровнять относительно горизонтальной поверхности. Существует два варианта. Первый – это тщательно выровненный песок, на который укладывается сетка.

Второй вариант – это монолитная бетонная подушка, что напоминает не очень высокий ленточный фундамент.

Для того чтобы сделать такую подушку, вам понадобится опалубка, арматура, проволока, цемент, песок, щебень. Раствор для подушки делают с помощью строительного миксера. Такая подушка высыхает на протяжении одной недели, после чего делается основная работа по укладке блоков. Обращаем ваше внимание и на то, что для установки блоков ФБС необходимо вырыть котлован, а не траншею.

Блоки такого типа соединяются между собой цементным раствором, который готовится непосредственно перед работой. Для прочности и устойчивости фундамента, специалисты рекомендуют дополнительно использовать арматуру, которая укладывается между блоками, и заливается раствором. Следите за тем, чтобы не было много воды в цементном растворе.

Укладка блоков ФБС напоминает обычную кладку из кирпича. Разница в том, что эти изделия имеют большой вес, а в процессе работы необходимо использовать специальную технику. Тщательно следите за отклонением ряда, а именно, чтобы оно не превышало допустимую норму, установленную ГОСТами.

Блоки укладываются так, чтобы верхнее изделие покрывало шов между двумя нижними.

Следует обратить внимание и на швы между блоками, которые обязательно необходимо защитить от вредных воздействий окружающей среды с помощью материала для гидроизоляции. Также необходима теплоизоляция, потому что через швы выходит все тепло, а в середину просачивается холодный воздух. Если соблюдать все рекомендации, то здание станет прочным и долговечным.

Если вы планируете построить гараж или другую конструкцию, то информация о том, как правильно выбрать материал для фундамента и блоки ФБС, фото на нашем сайте станут вам весьма полезными.

Алексей Молчанов, г. Пенза.

Еще по этой теме на нашем сайте.

Кабель ПВС расшифровка и основные параметры.

Кабель ПВС, расшифровка которого звучит как «соединительный провод в ПВХ оболочке», по своей конструкции ничем не отличается от аналогичных изделий. К основным характеристикам кабеля относится.

Кабель ВВГ расшифровка и основные характеристики.

Для передачи электроэнергии внутри зданий и сооружений, для освещения и обеспечения работы различного оборудования используется кабель ВВГ, расшифровка которого указывает на то, что медные жилы.

Провод ПВС расшифровка и технические характеристики.

Провод ПВС, расшифровка которого звучит как «провод в виниловой оболочке соединительный», применяется для передачи электроэнергии в производственных и бытовых условиях.

Кабель ПУГНП расшифровка и технические характеристики.

Провод ПУГНП, расшифровка аббревиатуры которого звучит как «провод универсальный гибкий плоский», широко применяется электриками. Выпускается провод в двух вариантах: двухжильном и трехжильном. Независимо от того.

Добавить комментарий Отменить ответ.

24.06.2017

ФБС — что это такое? Расшифровка ФБС

Основа любой постройки – грамотно созданный фундамент. Для обеспечения его прочности понадобятся качественные строительные материалы. Фундаментный блок стеновой (это расшифровка ФБС) поможет добиться успехов в создании надежной конструкции с небольшими затратами.

Что такое ФБС?

Фундаментные блоки, созданные для формирования основания дома, отлично выдерживают нагрузку и дают уверенность в том, что дом будет крепким, несмотря на возможные ошибки в строительстве. Изготавливают их из железобетона. Технические характеристики позволяют использовать ФБС и для возведения стен, и для монтажа опоры строения.

Применяют изделия в разных типах строительства, и они очень популярны. ФБС отличаются долговечностью, прочностью.

Из чего их изготовляют? Основой для фундаментных стеновых блоков (расшифровка ФБС) служит бетон – и легких, и тяжелых марок. При помощи арматуры они укрепляются, превращаясь в надежный строительный материал. Форма – параллелепипед.

Хороши такие блоки тем, что с их помощью фундамент и стены возвести проще и быстрее, можно уменьшить финансовые траты. Они помогают правильно распределить нагрузку на основание постройки и сделать стены прочными, морозостойкими.

Особенности монтажа стен

Конструирование зданий из блоков должно сопровождаться контролем каждого этапа работ. Наиболее ответственный момент – технология выполнения швов между составляющими. Их толщина не должна превышать 2 см, желательно, чтобы она была равна 1,5 см. Нужно следить за их заполнением, правильностью создания деформационных швов. ФБС блоки (расшифровка аббревиатуры – фундаментные блоки стеновые) не допускается укладывать так, чтобы швы между первым их рядом совпадали с расшивкой фундамента.

Укладывают на раствор цемента. При этом технология аналогична способу укладки кирпича. Чтобы блоки не отклонялись от вертикали во время проведения работ, используют отвес. Для правильного и ровного расположения в процессе строительства первого и следующих этажей руководствуются осями постройки. При помощи чертежа намечают расположение маячных блоков: для возведения здания их сначала размещают в углах и на пересечениях стен будущего здания. После этого можно укладывать остальные ФБС.

Монтаж фундамента

В начале разбивают оси для будущей основы здания. Готовят котлованы и траншеи, выравнивают их. Если блоки будут укладывать на песок, дополнительные работы не нужны. В случае работ с иным типом грунта необходима песчаная просыпка, шире, чем сами блоки. Дно котлованов перед укладкой ФБС должно быть сухим – без снега и дождевой воды.

При монтаже руководствуются чертежами. В начале работ укладывают маячные блоки, верх выравнивают при помощи нивелира. Крепят с помощью цемента по принципу кладки кирпича. Необходимо следить за качеством швов. Выравнивание стен подвала и выполненных из ФБС стен происходит по внутренней поверхности. Швы должны быть расшиты и заполнены. Фундамент — прочный и быстровозводимый.

Преимущества и недостатки

В первую очередь особое значение имеет скорость возведения здания из фундаментных стеновых блоков (расшифровка ФБС). Материал легок в обработке, удобен. Блоки могут иметь монтажные петли, но производят ФБС и без них.

Выделяют разные классы прочности материала, в зависимости от бетона, из которого он изготовлен: В 7.5, 12.5, 15. Существуют варианты поверхностей блоков: под покраску, под плитку, невидимая при использовании, лицевая. ФБС – прочный материал, стойкий к износу. Легко предсказать, как он поведет себя в различных условиях. Монтаж из ФБС в результате дает крепкие толстые стены, устойчивые к повреждениям.

К недостаткам можно отнести высокую стоимость материала. Кроме того, блоки ФБС обладают повышенной чувствительностью к переменам температуры и уровня влажности. Стоимость компенсируется тем, что материал дает результат быстро – здание строится без промедления, без трудностей.

Фундаментные стеновые блоки (расшифровка ФБС) дают возможность в короткие сроки возвести надежное, прочное здание. Требуется лишь соблюдать главные правила работы с материалом и придерживаться технологии.

Фундаментные блоки стеновые (ФБС) | KSG

    Блоки ФБС (фундаментные бетонные, стеновые) — типы и производство. В предыдущей статье: Бетонные блоки для строительства дома Фундаментные блоки, изготавливаемые из тяжелого бетона, являются главными элементами фундаментов ленточного типа. Также, они могут быть использованы для устройства цоколей. Тяжелые бетонные блоки характеризуются высокой прочностью и плотностью, вследствие чего они могут применяться в качестве опорных несущих конструкций, на которые приходятся большие нагрузки. Кроме того, они обладают хорошей гидроизоляцией и теплопроводностью, а использование специализированного оборудования для производства позволяют им иметь практически любую форму, объем, массу (вес). Не стоит путать фундаментные блоки стеновые с такими понятиями, как фанера бакелизированная или влагостойкая фанера. Бакелитовая фанера действительно может иметь обозначение с аналогичной аббревиатурой, но, как вы понимаете, это абсолютно разные материалы.

Типы фундаментных бетонных блоков:

  1. Фундаментные стеновые блоки (ФБС).
  2. Фундаментные пустотные блоки (ФБП).
  3. Дырчатые унифицированные блоки (УДБ). Данные блоки являются основными элементами прямоугольного сечения, внутри которых обустраиваются проемы прямоугольной формы с шагом в 600 миллиметров (высота блоков). УДВ высокого качества производятся на заводе с открытыми и закрытыми концами, с арматурными выпусками и другими аксессуарами в соответствии со спецификацией.

    Фундаментные стеновые блоки.

    Традиционным отечественным строительным материалом являются фундаментные стеновые блоки или ФБС. Эти блоки успешно зарекомендовали себя в частном малоэтажном и массовом высотном строительстве домов. При наличии грамотного проекта и плана работ, материал может применяться для обустройства фундаментов из блоков, а также для возведения стен для цокольных этажей и подземных частей (подвалов) домов, пристроек, сооружений, гаражей. Иногда к ФБС также причисляются монолитные фундаментные пустотные блоки и дырчатые унифицированные блоки специальной серии.

    Особенности производства ФБС.

    Фундаментные блоки стеновые, купить которые можно во многих строительных магазинах по нормальной цене, производятся на предприятиях ЖБИ, руководствуясь технологией изготовления конструкций из тяжелого и сверхтяжелого бетона, а также монтажной арматуры. Использование высококачественных материалов, ориентация на продуманность технологической цепочки, а также применение специальных станков, виброформ, металлоформ и т. д., приводят к появлению на рынке большого количества профессиональных строительных материалов с низкой себестоимостью, которые можно брать в расчет при реализации проектных чертежей, касающихся возведения надежных зданий и сооружений с опалубкой и без нее.

    Размеры ФБС блоков В соответствии с ГОСТ 13579 78 и соответствующими нормативами СНиП, стандартом для размеров или габаритов фундаментных стеновых блоков являются следующие параметры:

  • Длина – 60, 80, 90, 120 и 240 сантиметров.
  • Ширина – 30, 40, 50 и 60 сантиметров.
  • Высота – 30 и 60 сантиметров.

    Маркировка блоков ФБС.

    ФБС блоки имеют собственную маркировку, состоящую из цифр и букв. К примеру, если речь идет о блоке с маркировкой ФБС 24-6-6 т, то ее расшифровка означает фундаментный стеновой блок длиной 240 сантиметра и высотой/шириной по 60 сантиметров. Что касается буквы «т», то она указывает на то, что производство блока предусматривает использование бетона тяжелой марки.

    Использование блоков ФБС.

    Фундаментные стеновые блоки ФБС активно используются при возведении объектов со специальными техническими требованиями, с особыми техническими характеристиками. Вследствие этого, блоки для подвалов и подпорных стенок производятся из тяжелого бетона, силикатного бетона и керамзитобетона. Главным требованием, предъявляемым к использующемуся бетону, является плотность не меньше 1800 кг/м³. В отдельных случаях блоки стеновые ФБС должны подвергаться армированию с помощью специальных армированных элементов (армопояс). Такие блоки характеризуются наличием специальных транспортировочных петель для удобства перевозки. На торцах стеновых блоков присутствуют технологические пазы, куда при возведении фундамента будет закладываться раствор. Это придаст дополнительные прочностные характеристики зданию или сооружению.

    Как производится укладка стеновых блоков ФБС?

    Монтаж блоков ФБС 6 должен сопровождаться использованием технологии несовпадения (перевязки) вертикальных швов. Между швами при кладке должно быть предусмотрено расстояние не меньше 40 процентов от высоты бетонного блока. Если речь идет о прерывистом фундаменте на песчаной подушке, то межблочный вертикальный шов должен находится в пределах плит фундамента. Чтобы снизить количество типоразмеров фундаментных бетонных блоков по длине, в теле фундамента ленточного типа должны оставляться специальные проемы, длина которых не будет превышать 60 сантиметров. Впоследствии эти проемы, которые могут использоваться и для обустройства вводов коммуникаций и их установки, будут заполнены кирпичом или бетоном, без необходимости какого-либо демонтажа. Что касается выбора нужной формы ФБС и типа фундамента, который будет из них обустраиваться, то его изготовление производится на основании гидрогеологических и инженерно-геологических условий, характерных для строительной площадки. Кроме того, в расчет берутся конструктивные особенности и предназначение здания, а также величина нагрузки, которая передается на фундамент и ФБС.

Почему футбольные команды колледжей держат знаки за нарушение?

Одно из самых существенных различий между НФЛ и студенческим футболом заключается в том, как тренеры сообщают игровые вызовы. В НФЛ квотербеки могут получать звонки от своего тренера через специальное радио внутри своего шлема. В то же время в студенческом футболе тренеры должны контролировать свою игру со стороны.

Традиционно квотербеки носили наручные карточки — по сути, шпаргалки, которые позволяли им расшифровывать инструкции тренера.Но с ростом числа нарушений без совещаний команды начали переходить на более целесообразный вариант: карточки с символами.

Нарушение без совещаний

Несмотря на всю свою эффективность, нападение без совещаний также сопряжено с рядом проблем. Один из наиболее значимых касается способа общения между тренерами и квотербеками.Как упоминалось выше, до того, как студенческий футбол увлекся ажиотажем, квотербеки использовали карточки на запястье, чтобы расшифровывать игровые сигналы своего тренера — будь то слова, жесты или знаки.

Проблема в том, что декодирование игрового звонка с помощью наручной карты может занять много времени. Согласно Eleven Warriors, некоторые наручные карты содержат до 84 различных вариантов игры, а это означает, что квотербек должен использовать драгоценное время, чтобы найти подходящую игру на своей карте.

В этот момент квотербек должен сообщить об игре другим игрокам.С другой стороны, несколько игроков могут носить наручные карточки, чтобы независимо расшифровывать игру.

В любом случае, время, затрачиваемое на использование наручных карточек, делает этот подход практически несовместимым с сегодняшним стремительным наступлением без совещаний. Тренерам нужно было найти более быстрый способ донесения своих наступательных стратегий — такой, который не включал бы в себя игру, сбивающуюся между розыгрышами.

Использование знаков для объявления игр в студенческом футболе

Скамейка Клемсона держит знаки для пьес | Брайан Ротмюллер / Icon Sportswire через Getty Images

СВЯЗАННЫЙ: НФЛ не может признать огромную проблему Ник Чабб выделил

Современное нападение без хадла было введено около 10 лет назад Чипом Келли, тогда главным тренером Орегон Дакс.Чтобы ускорить процесс игрового вызова, Келли также разработала новую форму общения, которая включала в себя большие таблички, которые тренеры держали на боковой линии.

Эти знаки содержат комбинации слов, символов и изображений — от мема Плачущий Джордан до популярных персонажей видеоигр или голливудских знаменитостей. Для болельщиков и, что более важно, для противоборствующих команд эти карты кажутся совершенно случайными.

Тем не менее, игроков учат связывать каждый символ с конкретным заданием, что требует утомительного запоминания.

Тем не менее, при правильной реализации игровые позывные значительно ускоряют время общения, что позволяет тренерскому штабу читать и реагировать на действия защиты в режиме реального времени. Между тем, фанаты научились любить читать и пытаться расшифровывать символы знаков всякий раз, когда они появляются во время трансляции.

Ветры и температуры на высоте (FBs)

  • Ветры и температуры на высоте (FB) — это подготовленные компьютером прогнозы для конкретных мест на прилегающей территории U.S. и сеть местоположений на Аляске и Гавайях, основанная на прогоне модели прогноза в мезомасштабе Северной Америки (NAM) [рис. 1]
  • «FDWinds», теперь «FBwinds», выпускаются как в текстовом, так и в графическом формате
  • Эта информация помогает пилоту:
    • Определение наиболее благоприятной высоты на основе ветра и направления полета
    • Выявление зон возможного обледенения самолета путем регистрации температуры воздуха от +2°C до -20°C и температурных инверсий
    • Прогнозирование турбулентности путем наблюдения резких изменений направления и скорости ветра на разных высотах
  • Прогноз ветра и температуры на высоте состоит из двух основных элементов:
    • Уровни прогноза
    • Выдается для различных высот в зависимости от местоположения [Рисунок 4]
    • «FT» указывает уровни данных ветра и температуры
    • Группа из четырех цифр показывает направление ветра в десятках градусов, две вторые — скорость ветра в узлах
    • Высоты до 15 000 футов, уровни являются истинной высотой (ссылки на MSL)
    • Высоты на высоте 18 000 футов или выше, уровни являются барометрическими высотами (ссылки на FL)
    • Символическая форма прогнозов DDff+TT, в которой:
      • DD – направление ветра
      • ff скорость ветра, а
      • ТТ температура
    • Уровни прогноза
      • Данные прогноза ветра и температуры на высоте
      • В пределах 1500 футов от отметки станции не прогнозируется ветра
      • Прогнозируется истинный ветер, указанный в десятках градусов (две цифры) относительно истинного севера, а скорость ветра указывается в узлах (две цифры)
      • Если прогнозируемая скорость меньше 5 узлов, кодируется группа 9900, что означает «легкий и переменный».
        • 9

          : ветер слабый и переменный, температура 12°C

      • Если прогнозируемая скорость превышает 100 узлов, из скорости ветра вычитается 100, а к направлению ветра добавляется 50.
        • 731960:
          • Шаг 1: 73-50 = 23 или 230
          • Шаг 2: 19 + 100 = 119
          • Результат: [email protected] (температура -60°C)
      • Если прогнозируется скорость ветра 200 узлов или более, группа ветра кодируется как 99 узлов.
      • Температура не прогнозируется в пределах 2500 футов над уровнем моря от отметки станции
      • В столбце 3000 футов температуры не прогнозируются
      • Группа из шести цифр включает прогноз температуры в градусах Цельсия.
        • 192832: последние две цифры показывают 32°C для температуры, но помните, что выше 24 000′ отрицательный знак исключается
  • Данные прогноза ветра и температуры на высоте

Copyright © 2022 CFI Notebook. Все права защищены.| Политика конфиденциальности | Условия обслуживания | Карта сайта | Патреон | Контакт

Воздействие на путь модификации РНК m6A блокирует репликацию SARS-CoV-2 и HCoV-OC43 биологические процессы, влияющие на вирусную инфекцию биология (Раундтри и др., 2017; Гокхале и др., 2020). m

6 A является наиболее распространенной внутренней модификацией обоих кодов (Desrosiers et al.1974 год; Perry and Kelley 1974) и некодирующие РНК (Alarcón et al. 2015; Patil et al. 2016) и регулирует как их биологическую функцию, так и стабильность (Meyer and Jaffrey 2014). Как правило, m 6 Установка осуществляется комплексом ядерной метилтрансферазы («писатель») (METTL3/METTL14/WTAP), который включает в себя основные каталитическая субъединица метилтрансферазоподобного фермента 3 (METTL3) (Bokar et al. 1997; Liu et al. 2014; Wang et al. 2016; Schöller et al. 2018). Однако METTL3 также находится на промоторах специфических генов, независимых от METTL14, и катализирует котранскрипционные процессы. m 6 Метилирование ассоциированных транскриптов, активность, необходимая для поддержания лейкозного состояния (Barbieri et al.2017).

Положения m 6 Установка внутри мРНК строго контролируется, а модификация является динамической. Степень деметилирования цитоплазматической мРНК m 6 A остается спорной; однако была идентифицирована по крайней мере одна ядерная деметилаза («ластик»), ALKBH5 (Zheng et al. 2013; Ke et al. 2017; Darnell et al. 2018). m 6 A-модифицированные РНК распознаются рядом РНК-связывающих белков («ридеров»), включая ядерный YTHDC1 и три цитоплазматических паралоги YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3, а также другие РНК-связывающие белки (Lasman et al.2020; Заккара и Джеффри, 2020 г.). Хотя давно известно, что многие вирусные мРНК являются m 6 A-модифицированными, наше понимание того, в какой степени компоненты хозяина, которые устанавливают, удаляют или распознают m 6 A-модифицированную РНК, либо усиливают, либо подавляют вирусную инфекцию посредством различные механизмы остаются в зачаточном состоянии (Gonzales-van Horn and Sarnow, 2017; Tsai et al. , 2018; Williams et al., 2019).

Помимо формирования врожденного иммунного ответа хозяина, имеющего решающее значение для распознавания и ответа на вирусную инфекцию, m 6 A может также непосредственно влиять на экспрессию генов и репродукцию вирусов с ядерным жизненным циклом (Rubio et al.2018; Уильямс и др. 2019; Винклер и др. 2019; Гокхале и др. 2020; Ким и др. 2020б; Лу и др. 2020; Прайс и др. 2020; Шульман и Штерн-Гиноссар, 2020). Также было показано, что несколько одноцепочечных РНК-вирусов с положительным смыслом, которые реплицируются в цитоплазме, содержат m 6 A (Gokhale et al. 2016; Lichinchi et al. 2016; Hao et al. 2019). В случае вируса гепатита С (ВГС) истощение m 6 Авторы A METTL3/14 ограничивали продукцию инфекционных частиц ВГС и экспрессию белка без заметного изменения вирусной РНК синтез (Gokhale et al.2016; Гонсалес-ван Хорн и Сарноу, 2017 г.). Хотя β-коронавирусы представляют собой отдельное и важное семейство РНК-вирусов ( Coronaviridae ), которые также реплицируются исключительно в цитоплазме, то, как их продуктивный цикл роста может регулироваться хозяином m 6 Механизм модификации A, в значительной степени неизвестен. В дополнение к широко циркулирующим видам β-коронавирусов, ассоциированным с легкое заболевание, представленное HCoV-OC43 (Vijgen et al. 2005), возникающие вирусы, такие как SARS-CoV-2, могут быть гораздо более опасными, о чем свидетельствует глобальная пандемия COVID-19 (Исследовательская группа Coronaviridae Международного комитета по таксономии вирусов). 2020).Понимание того, как хозяин m 6 Механизм модификации влияет на репродукцию β-коронавируса, может предоставить новые терапевтические возможности для вмешательства репликации и распространения вируса и, возможно, выявить различия между пандемическими и непандемическими штаммами.

Результаты

Хозяин m

6 Факторы А способствуют репликации и распространению HCoV-OC43

Чтобы определить, регулирует ли клеточный механизм модификации m 6 A репликацию β-коронавируса, и определить вовлеченные факторы хозяина, сфокусированный скрининг РНКи было выполнено. Две разные миРНК были использованы для истощения 14 индивидуальных факторов хозяина, которые, как сообщалось, участвовали в инсталляции. удаление или распознавание m 6 A и подтверждена их эффективность в отношении истощения мишени (дополнительная рис. S1A). Обработанные РНКи культуры нормальных диплоидных фибробластов легких человека MRC-5 в 96-луночных планшетах впоследствии инфицировали при низкой множественность с HCoV-OC43, сезонным циркулирующим β-коронавирусом, обычно связанным с легким респираторным заболеванием у людей.В качестве меры размножения и распространения вируса были обнаружены инфицированные клетки, экспрессирующие белок нуклеокапсида (N) коронавируса. с помощью непрямой иммунофлуоресценции и количественной оценки с использованием платформы визуализации с высоким содержанием. По сравнению с контролем, обработанные несайленсинговой миРНК культурах, истощение отдельных субъединиц метилтрансферазы m 6 A и распознающих белков m 6 A значительно снижало процент N-экспрессирующих клеток (рис. 1А). Обе миРНК, специфичные для основной субъединицы метилтрансферазы m 6 A METTL14, и каталитической субъединицы METTL3 снижали N-положительную фракцию примерно на 30% и 20%, соответственно (рис. 1А). Слегка сниженная эффективность, наблюдаемая при использовании METTL3 по сравнению с METTL14 siRNA, согласуется с действием METTL3 в каталитической в отличие от стехиометрического способа и трудностей, связанных с достижением достаточного истощения ферментов. Только одна миРНК для оставшейся основной субъединицы метилтрансферазы WTAP снижала репликацию вируса (фиг.1A), что не объяснялось повышенной цитотоксичностью (дополнительная рис. S1B). Напротив, истощение некоровых субъединиц метилтрансферазы (RBM15, RBM15B и ZC3h23) с двумя разными миРНК каждая, либо не значительно снижал процент клеток, которые были обнаружены инфицированными, либо делал это только с одной миРНК. (ВИРМА) (рис. 1А). Кроме того, истощение другой m 6 A метилтрансферазы, METTL16, не оказывало заметного влияния на инфекцию (рис.1А). Таким образом, размножение и распространение HCoV-OC43 в фибробластах легких MRC-5 зависело от METTL3-содержащего m 6 A писателя.

Фигура 1.

Скрининг сфокусированной РНК-интерференции показывает, что METTL3 и считыватели YTHDF контролируют репликацию β-коронавируса. ( A ) Нормальные фибробласты легких человека MRC-5 трансфицировали набором проверенных миРНК (по две на фактор), нацеленных на 14 компонентов хозяина. пути m 6 A и культивировали в течение 72 часов до инфицирования HCoV-OC43 при множественности заражения = 0.001. Через 48 ч клетки фиксировались, и инфекция оценивают с помощью непрямой иммунофлуоресценции с использованием антител к вирусному нуклеокапсидному белку (N). Процент N-положительных клеток на лунку определяли с помощью платформы для скрининга с высоким содержанием CellInsight CX7 LZR. Каждый анализ проводили три раз с техническими дубликатами и нормализованными для контроля клеток, обработанных миРНК. ( B ) Влияние истощения siRNA на инфекционный вирусный титр определяли путем сбора надосадочной культуральной среды из A и установления TCID50 на клетках MRC-5.( C ) Клетки A549 +ACE2 трансфицировали проверенными миРНК, нацеленными на METTL3, YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3, по отдельности или в виде смеси отдельных siРНК ко всем трем белкам YTHDF с использованием siRNA#1 в каждом случае. Через 72 ч клетки инфицировали icSARS-CoV-2-mNG. при MOI = 0,1 в течение 48 ч, а затем фиксировали и оценивали по зеленой флуоресценции. Степень распространения была нормализована к клеткам, трансфицированным с контрольной миРНК. В каждом случае для установления статистических данных использовался тест ANOVA с коррекцией множественного сравнения Даннета. значимость по сравнению с контрольной siRNA. (*) P < 0,033, (**) P < 0,002, (***) P < 0,001.

В дополнение к хозяину m 6 Компоненты установки A, истощение специфических m 6 Распознающие белки A (считыватели) уменьшали долю HCoV-OC43-инфицированных клеток.Две siРНК, нацеленные на ядерный ридер m 6 A YTHDC1, снижали долю N-позитивных клеток на 30–45 % (рис. 1А). Аналогичным образом, обе siРНК против цитоплазматических ридеров m 6 A YTHDF1 и YTHDF3 снижали количество N-позитивных клеток на 40–50% и 25–40% соответственно (рис. 1А). Этот фенотип был селективным в отношении истощения YTHDF1 или YTHDF3, так как только одна миРНК, нацеленная на YTHDF2, уменьшала N-положительные количество клеток на 13% (рис. 1А). Кроме того, мы обнаружили, что при высокой множественности заражения (MOI) коделяция YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3 не заметно снизить общий уровень белка N через 24 часа сверх снижения, наблюдаемого при истощении либо YTHDF1, либо YTHDF3 в одиночку (дополнительный рис.С1Д). Наконец, только одна миРНК, специфичная для известных деметилаз ALKBH5 или FTO, уменьшала долю инфицированных. на> 25% (рис. 1A), но в случае FTO siRNA # 1 это может быть частично объяснено наблюдаемым снижением жизнеспособности клеток на 20% (дополнительная рис. S1B).

Чтобы установить, действительно ли снижение числа N-позитивных клеток отражает снижение репликации вируса, инфекционный вирус титры из отдельных культур, обработанных РНКи, измеряли с помощью анализа TCID50.По сравнению с контролем, обработанные несайленсинговой миРНК культур, истощение METTL3, YTHDF1 или YTHDF3 снижало репликацию вируса от трех до 24 раз (рис. 1B). В совокупности эти результаты показывают, что основные компоненты метилтрансферазы m 6 A METTL3/METTL14 и подмножество белков-считывателей m 6 A (YTHDF1, YTHDF3, YTHDC1) важны для размножения и распространения HCoV-OC43.

Продуктивной репликации SARS-CoV-2 противодействует истощение средств записи и чтения

Затем мы спросили, влияют ли распознающие белки m 6 A метилтрансферазы и m 6 A на репродукцию недавно появившегося пандемического β-коронавируса SARS-CoV-2, выполняя аналогичный скрининг РНКи направлен против более ограниченного набора клеточных мишеней.Поскольку фибробласты MRC-5 недостаточно для изучения продуктивного роста SARS-CoV-2, мы использовали клетки карциномы легких человека A549, сконструированные для конститутивной экспрессии рецептор ACE2 человека (A549 + ACE2 ). Кроме того, для идентификации инфицированных клеток использовали репортерный вирус SARS-CoV-2, экспрессирующий mNeonGreen (icSARS-CoV-2-mNG). и непосредственно отслеживать размножение и распространение вируса (Xie et al. 2020). По сравнению с контролем, миРНК без молчания, миРНК против METTL3 снижали процент инфицированных клеток на 78%. или 81% (рис.1С). Аналогичным образом, siРНК, специфичные для считывателей m 6 A YTHDF2 или YTHDF3, снижали процент mNeonGreen-позитивных клеток на 42–66 % или 75–76 % по сравнению с контролем соответственно. (рис. 1С). Напротив, первоначально протестированные миРНК YTHDF1 снижали инфекцию SARS-CoV-2 в разной степени: 68% (миРНК YTHDF1 № 1) и 23% (миРНК YTHDF1 № 2). Однако тестирование двух дополнительных миРНК, нацеленных на YTHDF1 (миРНК YTHDF1 № 3 и миРНК № 4), привело к в снижении SARS-CoV-2 на 79% и 89% по сравнению с контрольной миРНК, что согласуется с наблюдаемым более сильным ингибированием с использованием миРНК YTHDF1 № 1. Совместное заполнение всех трех клеточных ридеров m 6 A уменьшило количество mNeonGreen-позитивных клеток на 72% (рис. 1C). Никакого серьезного влияния на жизнеспособность клеток не было обнаружено при какой-либо обработке миРНК клеток A549 + ACE2 (дополнительная рис. S1D). Очевидная большая чувствительность SARS-CoV-2 к METTL3 и истощению белка считывателя по сравнению с HCoV-OC43 может быть связана с биологических различий между двумя вирусами, но также может быть объяснено различиями в типах клеток или динамике каждой инфекции.На примере METTL3 и YTHDF1 мы можем исключить различия в эффективности нокдауна между две клеточные линии (дополнительная рис. S1A, E). Эти данные показывают, что продуктивный рост SARS-CoV-2 зависит от метилтрансферазы основного хозяина m 6 A и цитоплазматических белков распознавания m 6 A. Таким образом, сезонный циркулирующий бета-коронавирус человека (HCoV-OC43) и недавно возникший пандемический бета-коронавирус (SARS-CoV-2) проявляют сходную зависимость от метилтрансферазы m 6 A хозяина и выбирают белки-считыватели m 6 A.

Ядерное накопление цитоплазматического m

6 A-ридеров при инфицировании HCoV43

Затем мы исследовали, как механизм модификации m 6 A реагировал на β-коронавирусную инфекцию. Нет существенных изменений в общем содержании 14 компонентов. клеточного m 6 Оцениваемый механизм модификации был обнаружен в течение 72 часов в инфицированных HCoV-OC43 фибробластах MRC-5 (рис.2А). Однако внутриклеточное распределение считывателей m 6 A YTHDF1 и YTHDF3 было изменено инфекцией. YTHDF1 преимущественно цитоплазматический в неинфицированных фибробластах MRC-5. и YTHDF3 оба накапливались в нуклеоплазме, о чем свидетельствует сохранение ядрышек в клетках MRC-5, инфицированных HCoV-OC43 (рис. 2B). Количественная оценка интенсивности ядерного сигнала в более чем 100 инфицированных клетках на условие показала статистически значимое увеличение в ядерных YTHDF1 и YTHDF3 и, в меньшей степени, в METTL3 (рис. 2С). Распределение YTHDF2, напротив, не было заметно изменено инфекцией, поскольку оно оставалось преимущественно цитоплазматическим. вместе с вирусным белком N (рис. 2B, C). Для дальнейшей оценки этого с использованием другой методологии было фракционировано равное количество инфицированных и неинфицированных клеток MRC-5. на растворимую (цитозольную) фракцию и твердую (ядерную) фракцию и исследовали с помощью иммуноблоттинга (рис. 2D). В соответствии с анализом непрямой иммунофлуоресценции METTL3 был обнаружен в обеих фракциях (рис.2D, дорожки 1, 2), но наиболее распространен в ядерной фракции. Разделение METTL3 и YTHDF2 между ядерным и цитозольным фракции не были заметно изменены инфекцией HCoV-OC43 (рис. 2D, сравните дорожки 3, 4 и 1, 2), и поэтому небольшое увеличение ядерного METTL3, обнаруженное с помощью непрямой иммунофлуоресценции (рис. 2C), не повторилось. Напротив, как YTHDF1, так и YTHDF3 были более распространены в цитоплазматической фракции неинфицированных животных. клеток, но были более многочисленны в ядерной фракции в клетках, инфицированных HCoV-OC43.Таким образом, ядерное накопление цитоплазматического m 6 Белки, распознающие A в ответ на инфицирование HCoV-OC43 легочных фибробластов MRC-5, были селективными в отношении YTHDF1 и YTHDF3.

Фигура 2. Инфекция

HCoV-OC43 приводит к накоплению в ядре METTL3, YTHDF1 и YTHDF2. ( A ) Лизаты из неинфицированных (UI) или HCoV-OC43-инфицированных клеток MRC-5 готовили через 8, 24, 48 и 72 ч после инфицирования в MOI = 3 и исследованы иммуноблотингом с использованием антител к субъединицам метилтрансферазы (METTL3, METTL14, WTAP, RBM15 и RBM15B), деметилазы (ALKBH5, FTO) и белки, связывающие m 6 A (YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3). Стрелки обозначают целевые диапазоны. ( B ) Изображения непрямой иммунофлуоресценции репрезентативных неинфицированных или инфицированных HCoV-OC43 клеток MRC5 (24 hpi, MOI = 3) с первичные антитела к METTL3, YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3. Масштабная линейка, 10 мкм. ( C ) Количественное определение ядерного сигнала для каждого первичного антитела, используемого в панели B , после нормализации по фоновой флуоресценции. Анализ проводили на ≥100 клеток/состояние и статистическую значимость определяется с помощью теста F .(****) P ≤ 0,0001, (**) P ≤ 0,0047, (нс) не значимо. ( D ) Неинфицированные и инфицированные HCoV-OC43 клетки MRC-5 (как в B ) быстро лизировали для получения нерастворимых твердых частиц (ядерных [N]) и растворимых (цитозольных [C]) фракций и исследовали с помощью иммуноблоттинга. с использованием антител к METTL3, YTHDF1, YTHDF2 и YTHDF3. Эффективность лизиса и субклеточного фракционирования оценивали с помощью антитела к цитоплазматическому β-тубулину и ядерному гистону h4.

Перераспределение и накопление в ядре YTHDF1, YTHDF2 или YTHDF3 не было обнаружено в клетках MRC-5, инфицированных УФ-инактивированным HCoV-OC43 и значительно снижается в клетках, инфицированных HCoV-OC43, обработанных ингибитором синтеза вирусной РНК ремдесивиром (дополнительная рис. S2A, B), что указывает на то, что накопление YTHDF1/3 в ядре зависит от экспрессии вирусного гена и/или активности популярный РНК-зависимая РНК-полимераза.В то время как цитоплазматический YTHDF1/3 перераспределялся HCoV-OC43-инфекцией клеток MRC-5 (рис. 2B, C), последовательных изменений в субклеточном распределении компонентов механизма модификации m 6 A, обычно находящихся в ядре, не наблюдалось, за исключением умеренное сокращение ядерный RBM15 и RBM15B (дополнительный рис. S3A, B). Напротив, никаких изменений в субклеточном распределении каких-либо компонентов механизма модификации хозяина m 6 A не было обнаружено в клетках A549 + ACE2 , инфицированных SARS-CoV-2 (дополнительная рис.S3C) или в ячейках Vero E6 (данные не показаны). Отражает ли это различия в том, как HCoV-OC43 и SARS-CoV-2 влияют на YTHDF1/3 внутриклеточное распределение, различные размеры инокулята или специфические для клеточных линий различия, такие как m 6 . Обилие факторов еще предстоит изучить.

РНК β-коронавируса m

6 A-модифицированы

Чтобы определить, изменяется ли установка m 6 A на клеточных транскриптах при инфицировании РНК SARS-CoV-2 или HCoV-OC43, мы выполнили meRIP-seq. (Рисунок.3) в шести биологических повторностях инфицированных и неинфицированных клеток A549 +ACE2 (SARS-CoV-2, MOI = 0,1, 48 ч) или клеток MRC-5 (HCoV-OC43, MOI = 3, 48 ч) и наблюдали устойчивая кластеризация биологических повторяется (дополнительный рис. S4A, B). Строгий вызов пиков с использованием ExomePeak2 (Meng et al. 2014) выявил от 6000 до 11000 областей пиков в наборах данных (рис. 3A), все из которых были обогащены каноническим мотивом DRACH, связанным с сайтами установки m 6 A ( Инжир.3B) и в основном группировались к границе между CDS и 3’UTR (рис. 3C), независимо от того, были ли клетки инфицированы или нет.

Рисунок 3.

РНК SARS-CoV-2 и HCoV-OC43 являются m 6 A-модифицированными. ( A ) Наборы данных meRIP-seq профилирования клеток A549 +ACE2 , инфицированных SARS-CoV-2, и клеток MRC-5, инфицированных HCOV-OC43, были проанализированы для определения количества значимых ( P adj < 0.05) диапазоны пиков, обогащенные входными данными, в каждом сравнении. ( B ) Анализ мотивов последовательности областей пиков, присутствующих в наборах данных клеточных meRIP-seq, показывает обогащение для классического RRACH/DRACH мотив, связанный с установкой m 6 A. ( C ) Анализ метагена m 6 Распределение области пика A по клеточным РНК с аннотированными 5′- и 3′-нетранслируемыми областями (UTR) и кодирующими последовательностями (CDS). ( D ) Интеграция предполагаемых диапазонов пиков m 6 A (фиолетовые), идентифицированных с помощью meRIP-seq клеток A549 +ACE2 , инфицированных SARS-CoV-2, с сайтами-кандидатами m 6 A (красные), идентифицированными с помощью сравнительное профилирование наборов данных прямого секвенирования РНК (DRS) в нанопорах (инфицированные SARS-CoV-2 клетки A549 +ACE2 с STM2457 или без него).Верхний трек показывает нормализованное покрытие репрезентативной биологической реплики парного INPUT meRIP-seq (черный) и IP. (красный) наборы данных (дополнительные повторы см. на дополнительном рис. S4). Чтобы максимизировать чувствительность и точность, сравнительный анализ DRS был выполнен с использованием DRUMMER на три разных уровня: полный экзом (т. е. все чтения), обработанный экзом (т. е. только чтения, содержащие лидерную последовательность) и изоформный уровень (т.е., наборы данных, выровненные с транскриптомом, а не с геномом). Каноническая структура транскриптома SARS-CoV-2 показано ниже. ( E ) То же, что и в D , но для клеток MRC-5, инфицированных HCOV-OC43, с STM2457 или без него.

Затем мы использовали зараженные вирусом наборы данных meRIP-seq, чтобы проверить, установлен ли m 6 A на РНК SARS-CoV-2 или HCoV-OC43.Из-за чрезвычайно компактной организации геномов β-коронавирусов мы обратились к MACS2 (Zhang et al. 2008) для выявления пиков и идентифицировал 14 (SARS-CoV-2) и шесть (HCoV-OC43) надежных и воспроизводимых областей пиков, обогащенных Образцы IP, которые мы предполагаем, отражают наличие одного или нескольких остатков m 6 A (рис. 3D, E; дополнительная рис. S4C, D). Примечательно, что несколько пиков были помещены в области, представленные только транскриптами длины генома (гРНК), что предполагает что как гРНК, так и субгеномные РНК (sgRNAs) являются m 6 A-модифицированными.Мы также сравнили области пиков SARS-CoV-2 с данными meRIP-seq и miCLIP от инфицированных SARS-CoV-2 Vero. и клетки Huh7, о которых сообщили Лю и его коллеги (Liu et al. 2021). Несмотря на различия в клеточных линиях и условиях заражения, было обнаружено, что 10 областей пика meRIP-seq перекрываются. между исследованиями, и четыре наших пика meRIP-seq перекрываются с сайтами, идентифицированными miCLIP (дополнительная рис. S5). Согласованность этих независимых исследований с использованием установленных линий раковых клеток человека (аденокарцинома легкого A549, Huh7 гепатоцеллюлярная карцинома) и нетрансформированная установленная клеточная линия почек африканской зеленой мартышки (Vero) подтверждает вывод что геномная и/или субгеномная РНК SARS-CoV-2 может содержать m 6 A.

Сравнивая модифицированные и немодифицированные РНК, мы использовали прямое секвенирование РНК с нанопорами (DRS) для идентификации повторяющейся последовательности. ошибки определения, которые соответствуют модифицированным основаниям и картам сайтов m 6 A при разрешении на уровне нуклеотидов и транскриптов (Price et al. 2020). Действительно, было хорошее соответствие между сайтами, обнаруженными с помощью этого подхода DRS, и областями пиков, определенными с помощью meRIP-seq. для полиаденилированных РНК, выделенных из клеток, инфицированных аденовирусом человека типа 5 (Ad5).Чтобы проверить, может ли DRS эффективно обнаружить m 6 Установка на РНК β-коронавируса, клетки были инфицированы SARS-CoV-2 (A549 +ACE2 ) или HCoV-OC43 (MRC-5) в тех же условиях, что и для meRIP-seq в присутствии STM2457, новый и высокоселективный низкомолекулярный ингибитор активности METTL3 (Янкова и др. , 2021) или структурно родственное контрольное соединение STM2120, которое более чем в 3000 раз менее эффективно, чем ингибитор METTL3, согласно анализ метилирования in vitro (дополнительный рис.С6). После воздействия DRS на фракцию поли(A) (рис. 3; дополнительная рис. S7A, B) было обнаружено, что структуры мРНК SARS-CoV-2 хорошо согласуются с более ранним исследованием DRS (Kim et al. 2020а). Впоследствии был проведен сравнительный анализ этих наборов данных с использованием двух различных информационных подходов: DRUMMER (Price et al. 2020) и ELIGOS2 (Jenjaroenpun et al. 2021). Удивительно, но только один сайт с низкой достоверностью SARS-CoV-2, который не соответствовал NNACN. Мотив, характерный для сайтов-хозяев m 6 A, был идентифицирован вместе с двумя сайтами с высокой степенью достоверности в HCoV-OC43 (AAACT и GAACT соответственно), которые соответствовали вырожденному мотиву m 6 A (рис.3; Дополнительный рис. S7A, B). Однако ни один из этих сайтов не был картирован в областях пиков, идентифицированных с помощью meRIP-seq, что повышает вероятность того, что они не подлинный m 6 A места установки. Таким образом, в отличие от многих сайтов, идентифицированных с помощью DRS на РНК-полимеразе II, транскрибируемых мРНК аденовируса и которые часто содержались в областях пиков meRIP-seq, соответствие между участками, обнаруженными DRS, и областями пиков meRIP-seq не наблюдалось на РНК β-коронавируса, которые транскрибируются кодируемой вирусом РНК-зависимой РНК-полимеразой в цитоплазме. структур, уникальных для этих вирусов.

Ингибирование METTL3 малыми молекулами ограничивает репликацию и распространение β-коронавируса

Установив, что m 6 A можно обнаружить на РНК β-коронавируса и что истощение либо METTL3, либо отдельных цитоплазматических белков m 6 A считывателя препятствует продуктивной репликации обоих вирусов, мы задались вопросом, является ли селективное ингибирование METTL3 каталитическая активность с использованием STM2457 может ограничивать репликацию β-коронавируса. После малочисленного заражения Легочные фибробласты MRC-5 с HCoV-OC43 или клетки карциномы легких A549 +ACE2 с SARS-CoV-2, культуры обрабатывали носителем (ДМСО), активным ингибитором METTL3 STM2457 или контрольное соединение STM2120. Как показано на рисунке 1, репликацию и распространение вируса отслеживали с использованием платформы визуализации с высоким содержанием для оценки экспрессии белка N (HCoV-OC43). или флуоресценцию mNeonGreen (icSARS-CoV-2-mNG).По сравнению с ДМСО или STM2120 более высокие концентрации ингибитора METTL3 STM2457 явно уменьшал количество клеток MRC-5, инфицированных HCoV-OC43 (рис. 4A, E), и клеток A549 + ACE2 , инфицированных icSARS-CoV-2-mNG (рис. 4B, E). Незначительные различия в жизнеспособности клеток MRC-5 и клеток A549 +ACE2 были обнаружены только при более высоких концентрациях, что указывает на то, что противовирусная активность STM2457 не является результатом общая токсичность в этих условиях анализа (фиг. 4С,Г). Для HCoV-OC43 снижение числа инфицированных клеток было впервые заметно при 8 мкМ STM2457 и далее увеличивалось в зависимости от дозы. способом до 30 мкМ, где наблюдалось ингибирование> 80% (фиг. 4А). Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) для STM2457 составляла ~21 мкМ. Репродукция SARS-CoV-2 в клетках A549 +ACE2 также подавлялась STM2457, с 10%-ным снижением числа клеток, экспрессирующих mNeonGreen, очевидным при 1,69 мкМ и увеличением дозозависимым образом до >90% снижения при 30 мкМ (фиг.4Б). IC50 для STM2457 против SARS-CoV-2 составила 16,84 мкМ. Обратите внимание, что использование двух разных моделей заражения исключает прямой сравнение чувствительности двух вирусов к STM2457.

Рисунок 4.

Ингибирование активности METTL3 подавляет репликацию β-коронавируса. ( A ) Клетки MRC-5 были инфицированы HCoV-OC43 при MOI = 0.001 в течение 48 ч в присутствии ингибитора METTL3 (STM2457, желтый), неактивное контрольное соединение (STM2120, серый) или носитель (ДМСО, белый) в указанных концентрациях. Выявление инфицированных клеток с помощью непрямой иммунофлуоресценции на нуклеокапсидный белок, как описано на рисунке 1А. ( B ) Клетки A549 +ACE2 были инфицированы icSARS-CoV-2-mNG при множественности заражения = 0,1 в течение 48 часов, и процент инфицированных клеток был установлен с помощью зеленая флуоресценция и нормализована к заражению необработанных клеток.( C , D ) Жизнеспособность клеток MRC-5 ( C ) и клеток A549 +ACE2 ( D ) в присутствии концентраций STM2120 или STM2457, используемых в тестах на инфицирование2, показанных в 9020 A и B оценивали с использованием коммерческого количественного анализа АТФ. Клетки поддерживали при 33°C или 37°C соответственно в культуре. среду, содержащую разбавленное соединение, за 48 ч до лизиса. Каждый эксперимент проводился трижды с внутренними дубликатами, нормализовано для обработанных ДМСО клеток, обработанных параллельно, и нанесено на график как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.( E ) Репрезентативные монтажи, показывающие лунки от инфекций, количественно определенных в A и B , которые были обработаны 30 мкМ STM2120 или STM2457 и инфицированы либо icSARS-CoV-2-mNG, либо HCoV-OC43, как указано. То сигнал для антитела OC43-N и вторичного антитела Alexa Fluor 647 представлен зеленым цветом. ( F ) Инфекционные титры вируса из клеток MRC-5, инфицированных HCoV-OC43, при множественности заражения = 0,001, обработанных 30 мкМ либо STM2120, либо STM2457 определяли с помощью анализа TCID50. ( G ) Инфекционные титры вируса из клеток A549 +ACE2 , инфицированных icSARS-CoV-2-mNG при MOI = 0,1 и обработанных 30 мкМ либо STM2120, либо STM2457, определяли по бляшкам проба. ( H , I ) MRC-5 и A549 +ACE2 клетки были инфицированы OC43 или icSARS-CoV-2-mNG соответственно, как в ( A ) и ( B ) в присутствии 30 мкМ STM2120 или STM2457 и 10 мкМ ингибитора JAK (пиридон-6) или контрольного носителя (ДМСО) и процент инфицированных клеток количественно.Каждый эксперимент проводили трижды с внутренними дубликатами, нормализованными к обработанным ДМСО. клетки обрабатывали параллельно и отображали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. ( J ) Иммуноблот-анализ лизатов клеток MRC-5, инфицированных HCoV-OC43, при множественности множественности = 0,001 в присутствии 30 мкМ STM2120 или STM2457, как в A , и собраны при 48 hpi и исследованы на вирусный белок N или ISG хозяина (ISG15, RIG-I, PKR и MDA5) и GAPDH.

Количественная репликация вируса показала, что STM2457 снижает продукцию инфекционного вируса HCoV-OC43 более чем в 100 раз (рис.4F) и производство инфекционного вируса SARS-CoV-2 в 300 раз (рис. 4G). Это соответствие дополнительно подтверждает достоверность анализа изображений с высоким содержанием как меру репликации и высвобождения вируса. Таким образом, селективный низкомолекулярный ингибитор METTL3 эффективно подавляет продуктивную репликацию двух β-коронавирусов человека, сезонный HCoV-OC43 и новый пандемический SARS-CoV-2.

Реакция интерферона на β-коронавирусную инфекцию не изменилась за счет ингибирования METTL3

Мы и другие исследователи показали, что истощение либо METTL3, либо METTL14 увеличивает накопление интерферона I типа (IFN). экспрессия противовирусного интерферон-стимулированного гена (ISG) в инфицированных вирусом клетках (Rubio et al.2018; Винклер и др. 2019; Цю и др. 2021). Чтобы спросить, может ли это объяснить снижение репликации и распространения β-коронавируса при ингибировании катализа METTL3 с использованием STM2457 клетки, инфицированные HCoV-OC43 (рис. 4H) или SARS-CoV-2 (рис. 4I), обрабатывали STM2120 или STM2457 в присутствии ингибитора пан-JAK для предотвращения индукции ответа IFN типа I. или управление автомобилем. Эта обработка не предотвратила ингибирующий эффект STM2457 на распространение любого вируса, но усилила его. репликация и распространение цитомегаловируса человека (ЦМВ) в первичных фибробластах (дополнительная фиг.S8A) и блокировал накопление фосфорилированного STAT1, субстрата JAK и стимулированного интерфероном белка IFIT2 (дополнительная фигура S8B). Количественное определение с помощью RT-qPCR мРНК для β-интерферона и интерферон-стимулированных генов IFIT2, ISG15 и OAS3 выявило очень умеренная индукция при заражении, которая не увеличивалась в присутствии STM2457 (дополнительная рис. S8C). Кроме того, иммуноблоттинг репрезентативных IFN-чувствительных белков ISG15, RIG-I, PKR и MDA5 не показал какого-либо увеличения. в обработанных STM2457 клетках, инфицированных HCoV-OC43, даже несмотря на то, что экспрессия вирусного белка N была снижена (фиг.4J) в соответствии с наблюдаемым снижением распространения вируса (фиг. 4A). Наконец, обработка клеток MRC-5 β-IFN приводила к надежной индукции множественных интерферон-стимулированных белков. подтверждая, что этот путь работает в этих клетках (дополнительная фиг. 8D). Эти результаты доказывают, что усиленная передача сигналов IFN I типа не отвечает за противовирусный эффект STM2457 против HCoV-OC43. или SARS-CoV-2.

Ингибирование METTL3 подавляет экспрессию гена HCoV-OC43

Чтобы лучше понять, как STM2457 препятствует репликации HCoV-OC43, клетки MRC-5 были инфицированы в высокой множественности, чтобы достичь синхронной инфекции в присутствии STM2457 или STM2120, а накопление белка N отслеживали с помощью иммуноблоттинга лизатов, собранных за 3 дня (рис. 5А). Это показало явное снижение количества белка N на 24 HPI в образце, обработанном STM2457, по сравнению с STM2120, хотя степень разницы уменьшилась как при 48, так и при 72 л.с. Однако эта задержка в накоплении вирусного белка может объясняться для уменьшенного распространения вновь синтезированного вируса, очевидного при 48 HPI (фиг. 4A).

Рисунок 5.

Первоначальный синтез РНК HCoV-OC43 и экспрессия белка снижаются за счет ингибирования катализа METTL3. ( A ) Иммуноблот-анализ лизатов клеток MRC-5, инфицированных HCoV-OC43, при МВД = 3 в присутствии 30 мкМ STM2120 или STM2457 собраны при 24, 48 или 72 HPI и исследованы на наличие вирусного белка N или METTL3 и GAPDH хозяина. ( B ) Репрезентативные изображения, показывающие обнаружение вирусного белка N или вирусной дцРНК с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа (зеленый) в HCoV-OC43-инфицированные клетки MRC-5 при 24 HPI в присутствии 30 мкМ STM2120 или STM2457. Ядра клеток окрашивали DAPI. Масштабная линейка, 20 мкм. ( С ). Относительное содержание гРНК HCoV-OC43 (ORF1ab) или sgRNA (N) или GAPDH хозяина при 24 hpi MOI = 3 в присутствии 30 мкМ STM2120 или STM2457 определяли с помощью RT-qPCR с использованием специфичных для транскрипта праймеров и нормализации к 18S рРНК и отображали как среднее ± SEM ( n = 3). ( D ) Клетки MRC-5, инфицированные HCoV-OC43 при множественности множественности = 3 в присутствии 30 мкМ STM2120 или STM2457, были метаболически мечены импульсами. с 35 S аминокислотами за 1 час.Лизаты разделяли с помощью SDS-PAGE и фиксированный высушенный гель экспонировали на пленке. Миграция молекулярных вес норм показан на слева . Стрелка на справа указывает на миграцию кодируемого вирусом белка N. Кроме того, относительные уровни общего eIF2α и фосфо-eIF2α в те же лизаты оценивали с помощью иммуноблоттинга. Обратите внимание, что сверхчувствительная улучшенная хемилюминесцентная подложка (SuperSignal West Femto) требовалось для визуализации очень низких уровней фосфо-eIF2α.( E , слева ) Цитоплазматические лизаты клеток MRC-5, инфицированных HCoV-OC43, обработанных STM2120 (серый) или STM2457 (желтый) в течение 24 ч до урожай фракционировали по градиенту сахарозы 10%–50%, и показано поглощение при 254 нм с указанием рибосомных пиков. ( Right ) Относительное количество вирусных N и ORF1a/b РНК и мРНК хозяина GAPDH в каждой градиентной фракции определяли с помощью RT-qPCR, представлена ​​сумма полисомных мРНК (фракции 13–20) при каждом лечении препаратом.Репрезентативный эксперимент из двух показаны биологические повторы, в которых были получены аналогичные результаты.

Некоторые из самых ранних этапов жизненного цикла коронавируса включают производство РНК с отрицательной цепью из входящей положительной цепи. шаблон и ремоделирование эндоплазматического ретикулума с образованием характерных двухмембранных везикулярных структур (репликация органеллы [ROs]) в цитоплазме, которые служат экранированными участками синтеза вирусной РНК (Kindler et al.2017; Снайдер и др. 2020). Эта стратегия репликации приводит к накоплению двухцепочечной РНК (дцРНК) в качестве промежуточного продукта репликации внутри клетки. цитоплазматические вирусные РО. Специфические антитела легко обнаруживают вирусный N-белок или dsRNA-содержащие точки у инфицированных HCoV-OC43. Клетки MRC-5 (фиг. 5B), обработанные неактивным соединением STM2120. Напротив, ингибитор METTL3 STM2457 подавлял накопление как дцРНК, так и в накоплении ROs и N-белка в цитоплазме.RT-qPCR с использованием транскрипт-специфических пар праймеров для различения вирусных гРНК (экспрессирующая Orf1ab) и репрезентативная sgRNA (экспрессирующая N) дополнительно продемонстрировали значительное снижение содержания как РНК, так и виды в присутствии STM2457, тогда как репрезентативная мРНК хозяина (GAPDH) оставалась одинаковой независимо от лечения (рис. 5С). Таким образом, ингибирование METTL3 приводит к снижению накопления вирусной РНК, что, в свою очередь, как ожидается, снижает накопление вирусного белка.

Для мониторинга влияния STM2457 на общий синтез вирусного белка клетки MRC-5, инфицированные HCoV-OC43, в присутствии либо STM2120, либо STM2457 подвергались пульсации с 35 S-мечеными аминокислотами. После разделения меченых вновь синтезированных белков с помощью SDS-PAGE наблюдается снижение синтеза белка на 30%. был очевиден в клетках, обработанных STM2457 (рис. 5D, сравните дорожки 1 и 2; дополнительный рис.С9А). Синтез множества белков-хозяев был снижен при инфицировании HCoV-OC43, что, вероятно, соответствует активности выключения хозяина. Nsp1 (Schubert et al. 2020; Zhang et al. 2021), и было очевидно накопление большого количества вирусных белков, включая N (рис. 5D, дорожки 3,4). В соответствии с данными иммуноблоттинга (фиг. 5А), скорость синтеза белка N была снижена в клетках, обработанных STM2457 (фиг. 5А, дорожка 4), по сравнению с контролем (фиг. 5А, дорожка 3). Дополнительные вирусные белки, синтезированные в изобилии в инфицированных клетках, обработанных контролем, были снижены в их синтезе. в присутствии STM2457 согласуется с широким ингибирующим действием на синтез вирусного белка и не ограничивается одним N.Кроме того, отключение хозяина оказалось сниженным в клетках, обработанных STM2457. Изменения в статусе фосфорилирования eIF2α, модификации которые опосредуют ингибирование трансляции в ответ на многочисленные состояния клеточного стресса, включая вирусные инфекции (Stern-Ginossar et al. 2019), не наблюдались ни при каких условиях (рис. 5D).

Чтобы непосредственно проверить влияние STM2457 на трансляцию вирусной мРНК, мы провели эксперимент по фракционированию полисом с использованием RT-qPCR. для оценки ассоциации вирусных мРНК с рибосомами (рис. 5Е). Примечательно, что >80% мРНК, кодирующих N, были связаны с несколькими рибосомами (полисомные фракции 13–20), и это было снижается до 62% при обработке STM2457 (рис. 5E; дополнительная рис. S9B). Полноразмерная гРНК (ORF1a/b) также была очень распространена во фракциях полисом и была аналогичным образом уменьшена с помощью STM2457. Чтобы выяснить, было ли сниженное представительство на полисомах избирательным для мРНК коронавируса, мы исследовали GAPDH, представителя клеточный транскрипт.Это было менее хорошо представлено во фракции полисом, что опять-таки согласуется с преобладанием вируса. РНК, но показало снижение при ингибировании активности METTL3.

В совокупности эти результаты показывают, что активность METTL3 способствует как раннему этапу репликации β-коронавируса, цикл, который предшествует накоплению dsRNA в вирус-индуцированных RO и трансляции вирусных мРНК. Как следствие, синтез гРНК и sgРНК, а также экспрессия вирусного белка N снижались за счет ингибирования METTL3-опосредованного катализа. Этот изменение накопления вирусной РНК, проявляющееся снижением синтеза вирусных полипептидов, в том числе эссенциальных Белок N и, таким образом, снижение производства и распространения вируса в культурах.

Обсуждение

Наше понимание того, как внутренние пути модификации РНК влияют на репликацию и распространение цитоплазматических РНК-вирусов, ограниченное.Здесь мы показываем, что для репродукции двух человеческих β-коронавирусов требуются основные клеточные белки m 6 A метилтрансферазы METTL3 и два белка распознавания m 6 A, YTHDF1 и YTHDF3. Каталитическая активность METTL3 необходима для эффективного синтеза вирусных РНК. в течение первых 24 ч инфекции и последующего накопления вирусных белков. Мы также показали, что РНК на основе антител захват (meRIP-seq), что вирусные мРНК являются m 6 A-модифицированными в нескольких областях, которые содержат консенсусные DRACH m 6 A акцепторные мотивы.Недавно Лю и соавт. (2021) сообщили о восьми высокодостоверных сайтах m 6 A на РНК SARS-CoV-2 с использованием комбинации meRIP-seq и miCLIP. Некоторые из этих областей перекрываются с meRIP-seq. пики, идентифицированные в нашем исследовании, но не с единственным сайтом с низкой достоверностью, предсказанным путем сравнения подготовленных наборов данных DRS. в присутствии или в отсутствие селективного низкомолекулярного ингибитора METTL3. Другое исследование с участием METTL3 в модификации вирусных РНК m 6 A и в регуляции ответов хозяина во время инфекции SARS-CoV-2 также появилось во время нашей рукописи. находился на пересмотре (Liu et al.2021).

Одно из правдоподобных объяснений того, почему методология DRS, которая успешно идентифицировала акцепторные сайты m 6 A в мРНК Ad5 (Price et al. 2020), предоставила здесь мало информации, заключается в том, что РНК коронавируса синтезируются кодируемой вирусом РНК-зависимой РНК. полимераза в уникальные индуцированные вирусом цитоплазматические органеллы модифицируются с гораздо меньшей частотой, чем мРНК хозяина или Ad5, которые транскрибируются РНК-полимеразой II в ядре.Более раннее исследование DRS РНК, выделенных из клеток Vero, инфицированных SARS-CoV-2, по сравнению с синтетическая немодифицированная РНК сообщила о 41 потенциальном сайте модификации оснований, почти половина из которых картирована на богатой пуринами AAGAA. мотив, в котором отсутствует канонический динуклеотид AC, обнаруженный в субстратах METTL3 (Kim et al. 2020a). Взятые вместе, эти результаты согласуются с возможностью того, что РНК β-коронавируса редко модифицируются и что потребность в каталитической активности METTL3, скорее всего, отражает модификацию мРНК хозяина таким образом, что полезно для вируса.В то время как в нашем исследовании не наблюдалось широко регулируемого ответа интерферона типа I, и, вероятно, оно может быть исключены, идентификация этих РНК хозяина должна быть высокоинформативной.

В дополнение к METTL3 мы также обнаружили, что члены семейства YTHDF считывателей m 6 A способствуют репликации β-коронавируса и что в клетках MRC-5 их субклеточная локализация может быть изменена с помощью Инфекция HCoV-OC43.Недавнее исследование, характеризующее интерактом SARS-CoV-2, выявило YTHDF2, но не YTHDF1 или YTHDF3. связаны с вирусной РНК (Schmidt et al. 2020). Неспособность идентифицировать белки YTHDF может отражать их низкую распространенность в клетках человека (Zaccara and Jaffrey 2020). Точно так же несколько недавних полногеномных скринингов CRISPR-Cas9 не смогли выявить участие белков домена YTH в контроле β-коронавируса. репликация (Daniloski et al. 2021; Schneider et al. 2021; Wang et al.2021; Вэй и др. 2021). По своей структуре эти объединенные экраны включают период расширения и отбора после введения векторов таргетинга. а также представить вирус смесью клеток с различными нарушениями генов, которые вместе могут ограничить обнаружение вируса. факторы, влияющие на репликацию и распространение, а не на проникновение в клетку. Временный нокдаун отдельного читателя представляет более однородной клеточной популяции и может быть достаточно краткосрочным, чтобы свести к минимуму компенсаторные изменения в экспрессии других факторы.Однако стоит отметить, что непрямые ридеры m 6 A из семейства белков IGF2BP (Sun et al. 2019) были идентифицированы в многочисленных интерактомных исследованиях РНК SARS-CoV-2, что подтверждает идею о том, что m 6 A установка на вирусные РНК влияет на интерактом РНК-белок (Flynn et al. 2020; Schmidt et al. 2020; Lee et al. 2021). Необходимо проверить, зависят ли эти ассоциации от метилирования РНК с помощью METTL3.

В совокупности наши результаты показывают, что функционирующий путь модификации m 6 A РНК благотворно влияет на репродукцию β-коронавируса и обеспечивает доказательство концепции, что нацеливание на клеточные Компоненты этого сейчас интенсивно изучаемого пути модификации РНК могут в конечном итоге привести к новым терапевтическим возможностям. для борьбы с этими важными вирусными патогенами.

Материалы и методы

Вирусы и клеточные линии

SARS-CoV-2, изолят USA-WA1/2020 (BEI Resources NR52281, подарок доктора Марка Маллигана, Нью-Йоркский университет, вакцина Лангоне) Center) амплифицировали один раз в клетках Vero E6 (P1 из исходного запаса BEI). Вкратце, колба Т175 со сливной конфлюэнтностью 90–95%, содержащая 1 × 10 7 Клетки Vero E6 инфицировали 10 мкл исходного раствора BEI в 3 мл инфекционной среды SARS-CoV-2 (DMEM, 2% FBS, 1% NEAA, 10 мМ HEPES при рН 7.0) за 1 час. Через 1 ч к инокуляту добавляли 15 мл инфекционной среды и клетки инкубировали в течение 72 ч. при 37°C и 5% CO 2 . Через 72 ч супернатант собирали, монослой замораживали и оттаивали один раз. И супернатант, и клеточные фракции объединяли, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин и фильтровали с использованием фильтрующего блока Steriflip 0,22 мкм (Millipore). mNeonGreen экспрессирующий рекомбинантный SARS-CoV-2 (icSARS-CoV-2-mNG) на основе изолята USA/WA/1/2020 (Xie et al.2020) был получен из Всемирного справочного центра UTMB по новым вирусам и арбовирусам и аналогичным образом амплифицирован с использованием 50 мкл исходного материала для инокуляции каждой колбы T175 клеток Vero E6. Все эксперименты с SARS-CoV-2 проводились в Утвержденный CDC/USDA объект BSL-3 в соответствии с рекомендациями Медицинской школы Нью-Йоркского университета для уровня биобезопасности 3.

HCoV-OC43 был получен от ATCC (ATCC VR-1558) и размножен в клетках MRC-5.Мы добавили 3 × 10 6 бляшкообразующих единиц (БОЕ) исходного материала пассажа 1 в 10-сантиметровую чашку с конфлюэнтностью 90–95% клеток MRC-5 в инфекционной среде OC43 (DMEM, 2% FBS, пенициллин/стрептомицин) и инкубировали 4 дня при 33°С. Монослой клеток отделяли с помощью клеточного скребка, собирали с супернатантом и центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин для удаления дебриса. Инфекционная доза культуры тканей 50 (TCID50) была установлена ​​на клетках MRC-5 и рабочий титр (бляшкообразующий единиц на миллилитр) оценивается как 0.7 TCID50/мл.

клетки A549, стабильно экспрессирующие человеческий ACE2 (A549 + ACE2 [de Vries et al. 2021]), любезный подарок Adil Mohamed и Meike Dittmann (Медицинская школа Нью-Йоркского университета), содержались в DMEM, 10% эмбриональная бычья сыворотка и пенициллин/стрептомицин при 37 °C с 5% CO 2 . К клеткам добавляли пуромицин (2 мкг/мл) через каждый второй пассаж. Клетки Vero E6 (ATCC CLR-1586) поддерживали в DMEM, 10% FBS, 1% заменимых аминокислот (NEAA) и пенициллин/стрептомицин при 37°C с 5% CO 2 .Клетки MRC-5 (ATCC CCL-171) выдерживали в среде DMEM, 5% FBS и пенициллин/стрептомицин при 37°C с 5% CO 2 в течение максимум 24 пассажей из исходных запасов.

Cellinsight CX7 LZR платформа для скрининга высокого содержания

Для мониторинга распространения вируса при медикаментозном лечении и в условиях нокдауна генов клетки высевали в 96-луночные лунки с черными стенками и прозрачным дном. тарелки.Для инфицирования icSARS-CoV-2-mNG клеток A549+ACE2 на следующий день среду удаляли и заменяли средой, содержащей препараты или контроль носителя (ДМСО) за 2 часа до заражения. Клетки инфицировали в инфекционной среде SARS-CoV-2 при MOI = 0,1 в присутствии препарата/носителя и инкубируют в течение 48 ч при 37°С. Клетки фиксировали в 10% растворе формалина в течение 30 мин и пермеабилизировали. в 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут перед окрашиванием DAPI и окончательной промывкой PBS перед анализом.Для инфекций HCoV-OC43, Клетки MRC-5 инфицировали при MOI = 0,001 в инфекционной среде OC43 при 33°C. При 48 HPi клетки фиксировали в 4% параформальдегиде. в течение 30 мин и пермеабилизированы в 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин перед блокированием в буфере, блокирующем иммунофлуоресценцию. (4% FBS в PBS) в течение 1 часа. Инфицированные клетки выявляли путем инкубации с антителом против OC43-N (1:1000) в течение ночи при 4°C с последующим путем инкубации с вторичным антимышиным Alexa Fluor 647 (Invitrogen A32787) и DAPI в течение 2 ч при комнатной температуре.Тарелки были получено с помощью платформы для скрининга высокого содержания CellInsight CX7 LZR путем сбора девяти изображений с 4-кратным увеличением для охвата весь колодец. Программное обеспечение HCS Navigator использовалось для количественного определения количества клеток с помощью окрашивания DAPI и процента инфицированных клеток. на это указывает положительный результат mNeonGreen или Alexa Fluor 647.

Анализ зубного налета и определение TCID50

титров SARS-CoV-2 были определены с помощью анализа бляшек на клетках Vero E6.Вкратце, 5 × 10 5 клеток Vero E6/лунку высевали в 12-луночный планшет. На следующий день серийные 10-кратные разведения вируса в среде DMEM с добавлением К клеткам добавляли 2% FBS и инкубировали 1 ч при 37°С. Затем клетки покрывали 0,8% агарозой в DMEM + 2% FBS. и инкубировали 72 ч при 37°С. Клетки фиксировали 10% формалином и после удаления агарозной пробки окрашивали кристаллическим фиолетовым. Вирусный запас OC43 и супернатанты эксперимента титровали, устанавливая инфекционную дозу культуры ткани (TCID50) на Клетки MRC-5, оценка CPE после инкубации в течение 7 дней при 33°C.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по крайней мере пяти экспериментов.

Обработка ингибиторами

Низкомолекулярные ингибиторы STM2120, STM2457 и ремдесивир (Medchem Express HY-104077) были восстановлены в ДМСО в виде 10 исходный раствор мМ и затем разводят в подходящей инфекционной среде перед обработкой клеток. Запасы соединений СТМ хранили при -20°С, тогда как ремдесивир хранили при -80°С.Ингибитор пан-янусовой протеинтирозинкиназы (JAK) пиридон 6 (Millipore-Sigma 420099) восстанавливали в ДМСО и использовали в концентрации 10 мкМ.

Анализ жизнеспособности клеток

Для определения жизнеспособности клетки высевали в непрозрачные белые 96-луночные планшеты. На следующий день клетки обрабатывали лекарственным средством или носителем. и инкубировали, как в экспериментах по инфицированию (например, обработанные MRC-5 клетки помещали на 48 ч при 33°С).Уровни АТФ были затем анализировали с использованием Celltiterglo2.0 (Promega G9242) в соответствии с инструкциями производителя. Сигнал люциферазы был прочитан на многофункциональном ридере Perkin Elmer Envision 2103 и 24-часовая обработка 1 мкМ стауроспорином, используемая в качестве положительного контроля для анализа чувствительность.

Анализ RT-qPCR

Суммарная РНК была выделена из инфицированных клеток с использованием TRIzol.Для каждого образца 500 нг РНК подвергали синтезу кДНК с использованием QScript XLT (Quanta). Реакции количественной ПЦР (кПЦР) проводили с использованием супермиксов Bio-Rad SsoAdvanced SYBR Green и Система реального времени Bio-Rad CFX96. Последовательности праймеров подробно описаны в дополнительной таблице S1. Для каждой биологической повторности были проведены технические повторы. Уровни мРНК относительно 18S рРНК рассчитывали с использованием метод ΔΔCT, а статистический анализ проводили с помощью GraphPad Prism.

Анализ полисом и метаболическое мечение с помощью

35 S-аминокислот

клеток MRC-5 (7,2 × 10 6 ) инкубировали с 100 мкг/мл циклогексимида (Sigma C7698) в течение 10 мин при 37°C и 5% CO 2 перед лизисом в буфере для лизиса полисом (20 мМ Tris при pH 7,5, 0,05 М KCl, 10 мМ MgCl 2 , 100 мкг/мл циклогексимида), содержащие 1% Triton X-100 и 100 ЕД/мл ингибитора РНКазы RiboLock (ThermoFisher Scientific, EO0381). После инкубации в течение 10 мин на льду ядра осаждали центрифугированием при 20000 g в настольной микроцентрифуге в течение 5 мин при 4°С. Цитоплазматический лизат наслаивали на градиенты 10–50% сахарозы (при лизисе полисом). буфер с 100 мкг/мл циклогексимида) в тонкостенных полипропиленовых ультрацентрифужных пробирках (Beckman Coulter 331372). Градиенты центрифугировали при 38000 об/мин в течение 2,25 ч при 4°C в роторе SW41Ti (Beckman Coulter 331362).Были созданы профили поглощения путем прокачки градиентов через проточную кювету при измерении поглощения РНК при 254 нм с использованием фракционирования с градиентом плотности Система (Брандель, BR-188). РНК выделяли с помощью тризола и равным объемом из каждой фракции, подвергнутой синтезу кДНК и последующая RT-qPCR, как описано выше. Метаболическое мечение 35 S-аминокислот проводили, как описано ранее (Burgess and Mohr 2015).

Иммуноблоттинг и фракционирование клеток

Антитела

и их соответствующие разведения, используемые для иммуноблоттинга, перечислены в дополнительной таблице S2. Иммуноблоты визуализировали с помощью системы iBright system CL1000 (Life Technologies). Для генерации твердых частиц (ядерных) и растворимые (цитоплазматические) фракции, неинфицированные и инфицированные HCoV-OC43 клетки MRC5 лизировали ресуспендированием в буфере с низким содержанием солей. (20 мМ HEPES при pH 7.9, 10% глицерин, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,05% NP40, ингибиторы протеазы) и инкубировали 5 мин на льду перед центрифугированием при 1000 г g в течение 5 мин при 4°С. Супернатант (цитозольная фракция) собирали и сохраняли. Ядерный осадок промывали тем же буфера один раз и ресуспендировали в 1× буфере для образцов Лэммли, денатурировали в течение 5 мин при 100°C и сохраняли (ядерная фракция). Лизис и эффективность субклеточного фракционирования контролировали с помощью блоттинга для β-тубулина (цитоплазматического) и гистона h4 (ядерного).

Экран интерференции РНК

Используемые siRNA

подробно описаны в дополнительной таблице S3. Клетки высевали на 96-луночные планшеты с прозрачным дном и черными стенками и на следующий день трансфицировали с использованием 3 мкл/мл липофектамина. RNAiMax (Life Technologies) при конечной концентрации миРНК 20 нМ. Через три дня после трансфекции клетки MRC-5 инфицировали с OC43 при MOI = 0.001 и A549 +ACE2 клетки, инфицированные icSARS-CoV-2-mNG, при множественности заражения = 0,1. При 48 HPI клетки фиксировали и окрашивали, как подробно описано выше, до инфицирования. количественное определение клеток. Эффективность нокдауна была установлена ​​путем воспроизведения условий трансфекции в 12-луночных планшетах и ​​анализа истощение целевого белка с помощью иммуноблотинга, где это возможно, или истощение мРНК-мишени с помощью RT-qPCR.

Непрямая иммунофлуоресценция

Клетки высевали на предметные стекла лунок камеры и после инфицирования фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут и пермеабилизировали. с 0.2% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин. Затем клетки инкубировали с блокирующим раствором (4% FBS в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. температуры и инкубировали с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе, в течение ночи при 4°С. Для первичной дцРНК (J2) антител, инкубация 2 ч при комнатной температуре. Используемые первичные разведения антител перечислены в дополнительной таблице S2. Клетки пять раз промывали PBS, инкубировали с антимышиным IgG Alexa Fluor-488 (Invitrogen A11029) или антикроличьим IgG. Антитела Alexa Fluor-555 (Invitrogen A21429), разведенные в блокирующем растворе, выдерживали 40 мин при комнатной температуре, отмывали пять раз. с PBS и окрашивали DAPI в предпоследней промывке перед заливкой в ​​флуоресцентную среду для заливки (Dako S302380-2).Для субклеточной локализации фактора m 6 A клетки визуализировали с помощью конфокального микроскопа Zeiss 880 при 63-кратном увеличении, ядерную Интенсивность сигнала в неинфицированных и инфицированных клетках (≥100 клеток/состояние) была количественно определена с использованием ImageJ (Schneider et al. 2012). Статистические данные представлены как среднее ± SEM, как описано в соответствующих подписях к рисункам, и статистическая значимость определяли с помощью теста F с GraphPad Prism 8. P < 0,05 считалось статистически значимым. Для локализации дцРНК и N-белка после лечения лекарствами клетки визуализировали с помощью микроскопа Leica DM5000 с 63-кратным объективом с использованием программного обеспечения Leica Imaging LAS V4.3.

Анализ метилтрансферазы in vitro

Ферментативный анализ был установлен для определения значений IC50 для ингибирования активности РНК-метилтрансферазы. Фермент использовали полноразмерный his-меченый METTL3, коэкспрессированный с полноразмерным FLAG-меченым METTL14, полученным в бакуловирусной экспрессии система. Ферментный комплекс очищали с помощью стандартной аффинной хроматографии. Ферментативные реакции проводили при комнатной температуры в 384-луночных планшетах с использованием конечного реакционного объема 20 мкл, содержащего 20 мМ TrisCl (pH 7,6), 1 мМ DTT и 0,01% Твин-20. Конечная концентрация 5 нМ ifMETTL3/14 была предварительно инкубирована с различными концентрациями соединения в течение 10 минут, а затем добавлением 0.Конечная концентрация синтетического РНК-субстрата 2 мкМ (5′-UACACUCGAUCUGGACUAAAGCUGCUC-3′) и конечная концентрация 0,5 мкМ метил-донор S-аденозилметионин (SAM). Реакцию инкубировали еще 60 мин при комнатной температуре, а затем гасили. добавлением 40 мкл 7,5% ТХУ с внутренним стандартом. После завершения планшеты запечатывали, центрифугировали и хранили. при 4°C до анализа. Активность METTL3 оценивали с использованием платформы масс-спектрометрии RapidFire (RF/MS) для измерения Продукт S-аденозилгомоцистеина (SAH).Остановленные и стабильные аналитические планшеты анализировали на встроенном автодозаторе/твердых пробах Agilent RF300. система фазовой экстракции (ТФЭ), соединенная с масс-спектрометром ABSciex 4000 для количественного определения SAH и нормализованных отношению сигнала двух внутренних стандартов. Переход массы продукта (SAH) составил 384,9/135,9 Да. Переходы внутреннего стандарта использовали для нормирования матричных эффектов. Значения IC50 были рассчитаны на основе серий разведений. отдельных соединений.Активность соединения измеряли при различных концентрациях ингибитора и нормализовали по контрольным лункам. без РНК-субстрата и без ингибитора (только ДМСО).

Количественное определение нуклеозидов РНК методом масс-спектрометрии

клеток Kasumi-1 выращивали в RPMI-1640 с добавлением 20% FBS и поддерживали в культуре от 0,3 × 10 6 до 1,5 × 10 6 клеток/мл.Клетки промывали в PBS и ресуспендировали в RPMI-1640 без L-метионина (Thermo Fisher Scientific), 20% FBS. и 30 мг/л L-метионина (99% метил- 13 C; 98% метил-D3) (Cambridge Isotope Laboratories). Клетки высевали в 96-луночные планшеты с круглым дном и низким прикреплением (Corning). по 25 000 клеток на лунку с соединениями и инкубацией в течение 16 часов. Для анализа клетки осаждали и быстро замораживали при -80°C. в течение 10 мин.Затем планшет оттаивали и в каждую лунку добавляли по 100 мкл смеси нуклеазного гидролизата, содержащей 62,5 ЕД бензоназы. (Sigma Aldrich), 5 ЕД антарктической фосфатазы (NEB) и 10 мЕд/мкл фосфодиэстеразы I (Sigma Aldrich) в 20 мМ Tris-HCl (pH 8), 20 мМ MgCl 2 и 100 мМ NaCl и инкубировали в течение ночи при 37°С. Сто микролитров ледяной 0,1% муравьиной кислоты, содержащей 1 мкг/мл в каждую лунку добавляли уридин-13C9,15N2 и переносили на 96-луночный фильтр AcroPrep Advance с молекулярной массой 30 кДа. планшет (Pall Laboratories) и центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин в свежий 96-луночный планшет.Образцы анализировали на масс-спектрометре Triple Quad 4500 (Sciex) с питанием от Dionex. Стандартный поток U3000 UPLC (термо). Разделение осуществлялось градиентом 2–10 % ацетонитрила с постоянной концентрацией 0,1% муравьиной кислоты на колонке Acquity UPLC HSS T3, 100 Å, 1,8 мкм, 2,1 мм × 100 мм, которую выдерживали при 15°C. Последующий переходы контролировали для указанных аналитов: аденозин: 268,06 > 135,80; цитидин: 244.06 > 111,90; гуанозин: 284,11 > 152,10; уридин: 245,02 > 113,0; тяжелый уридин: 256,03 > 119,00; м 6 А: 282,08 > 149,90; и тяжелый м 6 А: 286,08 > 153,90.

Экстракция РНК, meRIP и подготовка библиотеки секвенирования

Следующий протокол был адаптирован из Zeng et al. (2018). Вкратце, тотальную РНК выделяли из инфицированных и неинфицированных клеток с помощью тризола и до 10 мкг обрабатывали 2 ед. ДНКазы I (Roche Diagnostics) в течение 10 мин при 37°С.РНК фрагментировали с использованием 10-кратного буфера для фрагментации РНК (Thermo Fisher Scientific). в предварительно нагретом термоциклере в течение 6 мин при 70°С перед остановкой реакции 0,5 М ЭДТА и инкубацией на льду. Следующий очистки этанолом, 10% фрагментированной РНК сохраняли в качестве исходных данных, а остальную часть подвергали meRIP. Кратко, 50:50 смесь гранул белка A и белка G промывали 1× буфером IP (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl при pH 7.5, 0,1% NP40) и с 5 мкг антитела EpiMark N 6 -метиладенозин в течение ночи при 4°C. Фрагментированную РНК инкубировали при 4°С с конъюгатом антитело-гранулы в течение 2 ч и затем затем один раз промывали буфером 1× IP и дважды буфером 1× с низким содержанием соли (50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl при pH 7,5, 0,1% NP40) и 1× высокосолевой (500 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl при ifpH 7,5, 0,1% NP40) IP-буфер перед элюированием в 200 мкл RLT-буфера из набор RNeasy (Qiagen) и экстракция в соответствии с протоколом производителя перед элюированием 14 мкл не содержащей нуклеазы H 2 0.

Валидацию

meRIP проводили путем синтеза кДНК с использованием набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости (Thermo Fisher Scientific) для количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, нацеленных на GAPDH и SETD7 (Zeng et al. 2018), с минимальным 50-кратным увеличением SETD7 по сравнению с GAPDH, необходимым для того, чтобы образец meRIP считался успешным.

Библиотеки секвенирования для исходных и внутрибрюшинных фракций были приготовлены с использованием набора SMARTer stranded total RNA-seq kit версии 2 (Pico вводное млекопитающее, Takara Biosciences) со следующими модификациями.IP (3,5 мкл) и 100 нг исходного вещества использовали в качестве исходного материал, вводимый в протокол при добавлении смеси для синтеза кДНК первой цепи (т. е. без фрагментации). Для заключительный этап ПЦР, 12 циклов амплификации использовали для исходных образцов и 16 циклов для IP. Очищенные проиндексированные библиотеки были затем мультиплексированы и секвенированы в режиме парных концов (100 циклов) на проточной кювете Illumina NovaSeq SP1.

Обработка и выравнивание данных meRIP-seq

Наборы данных чтения последовательности были обрезаны с помощью TrimGalore (https://www. bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore) для удаления адаптерных последовательностей, низкокачественных оснований на 3′-концах и первых трех нуклеотидов в прочтении R2 (trim_galore –paired –длина 30 –clip_R2 3). Этот последний этап необходим для удаления дополнительной последовательности адаптера, присутствующей на 5′-конце. Обработанные наборы данных были конкурентно сопоставлены с использованием STAR, выравнивателя, поддерживающего сплайсинг (Dobin et al. 2013), по индексу генома, объединяющему геном человека (hg38), эталонный геном HCoV-OC43 (NC_006213.1) и SARS-CoV-2. Штамм WA1 (MN985325.1). Были сохранены только однозначно выровненные чтения (–outFilterMultimapNmax 1) для последующей обработки с помощью SAMtools (Ли и др., 2009). Здесь отсортированные файлы BAM были разделены, чтобы предоставить отдельные файлы для каждой последовательности генома и данных SARS-CoV-2 и HCoV-OC43. наборы (входные и IP), нормализованные путем случайной выборки для получения, соответственно, 500 000 и 200 000 уникальных выравниваний с использованием переформатировать.sh из пакета bbmap (https://sourceforge.net/projects/bbmap).

Чтобы изучить изменчивость между условиями и биологическими репликами, входные наборы данных и наборы данных IP также были псевдовыровнены относительно транскриптом hg38 (кодирующий белок и длинные некодирующие РНК) с использованием Kallisto (Bray et al. 2016) с последующим преобразованием количества транскриптов в количество генов. Затем перед генерацией использовалось преобразование, стабилизирующее дисперсию образцы корреляционных матриц расстояний.

пиковый вызов meRIP-seq

Пиковый вызов hg38 был выполнен с использованием ExomePeak2 (Meng et al. 2014) со следующими флагами (paired_end=true, library_type=1st_strand,consistency_peak=TRUE, genome=»hg38″,peak_calling_mode=»full_tx»), и только постоянно обнаруживаемые пики с P adj < 0,05 считались истинно положительными. Каждый набор данных (состоящий из шести биологических повторов ввода и IP) был проанализирован. индивидуально и в сравнении (зараженные SARS-CoV-2 против инфицированных).неинфицированные и инфицированные HCoV-OC43 по сравнению с неинфицированными).

Пиковый вызов для SARS-CoV-2 и HCoV-OC43 был выполнен для выборки файлов BAM с использованием MACS2 (Zhang et al. 2008) со следующими флагами (-f BAMPE -g 30000 -q 0,05 -B –call-summits –keep -dup auto –nomodel –extsize 150).

Открытие мотивов и анализ метагенов

Диапазоны пиков, полученные в результате анализа exomePeak2, были обработаны с использованием findMotifsGenome. pl из пакета HOMER (Heinz et al. 2010) со следующими параметрами: -mask -size заданный -norevopp -S 5, -len 5,6,7,8,10,12. Метагенный анализ проводили с использованием metaPlotR (https://github.com/olarerin/metaPlotR).

Прямое секвенирование РНК с нанопорами

Библиотеки для прямого секвенирования РНК были созданы из 400–1000 нг поли(А) РНК, выделенной с помощью очистки мРНК Dynabeads. горит (Invitrogen 61006).Выделенную поли(А)РНК впоследствии добавляли 0,5 мкл синтетической енолазы 2 (ENO2) для калибровки. РНК (Oxford Nanopore Technologies Ltd.) и подготовлена ​​для секвенирования с использованием протокола производителя SQK-RNA002. со следующими модификациями: Синтез первой цепи проводили с использованием SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific) и время инкубации доведено до 90 мин.

Секвенирование проводили на MinION MkIb с использованием R9.4.1 (ред. D) проточные кюветы (Oxford Nanopore Technologies Ltd.) на 24–48 ч. (одна библиотека на проточную ячейку), что дает от 170 000 до 870 000 считываний на набор данных. Необработанные наборы данных fast5 используя Guppy v3.6.0 (-c rna_r9.4.1_70bps_hac.cfg -r –calib_detect –trim_strategy rna –reverse_sequence true) только для чтения попутный фильтр, используемый для последующих анализов.

считывания последовательности были сопоставлены либо с SARS-CoV-2 (MN985325.1) или последовательность генома HCoV-OC43 (NC_006213.1) с использованием MiniMap2 (-ax splice -k 8 -w 3 -g 30000 -G 30000 -C0 -un –no-end-flt –splice-flank=no), выравниватель, поддерживающий сращивание (Li 2018), с последующим разбором через SAMtools и BEDtools (Куинлан и Холл, 2010). Последующие анализы проводились с использованием либо полного выровненного набора данных (полный экзом), либо обработанного набора данных (обработанный экзом), в которых сохранились только вирусные риды, содержащие лидерную последовательность (LS) SARS-CoV-2 или HCoV-OC43 и поли(A)-хвост (22%–68% прочтений).Мы дополнительно выполнили выравнивание на уровне изоформ с помощью MiniMap2 (-ax map-ont -L -p 0,99) против обоих вирусные транскриптомы (полученные из аннотаций их канонических транскриптов) и транскриптом hg38, содержащий белок, кодирующий и длинные некодирующие РНК. Здесь использовался дополнительный синтаксический анализ с помощью SAMtools (-F 2324 -q 10), чтобы сохранить только первичные выравнивания. (флаг SAM 0) с качеством отображения (MapQ) > 0.

Обнаружение модификации РНК

Мы использовали DRUMMER (https://github. com/DepledgeLab/DRUMMER) для сравнительного профилирования наборов данных DRS. При представлении двух наборов данных, сопоставленных с одним и тем же геномом или транскриптом (например, выровненные наборы данных DRS, полученные из инфицированных SARS-CoV-2 клеток MRC-5, обработанных либо ингибитором METTL3, STM2457 или неингибирующий контроль STM2120), DRUMMER идентифицирует отдельные нуклеотиды, в которых частота ошибок базового вызова различается. статистически устойчивым образом (Price et al.2020). Альтернативное профилирование с использованием ELIGOS2 (Jenjaroenpun et al. 2021) было выполнено с использованием набора данных Full Exome со следующими флагами «–pval 0,05 –oddR 1,5 –esb 0».

Доступность данных

Все наборы данных секвенирования, связанные с этим исследованием, были депонированы как fastq (Illumina) или fast5 (nanopore) в Европейском Архив нуклеотидов (ENA) в рамках проекта PRJEB42052.

Благодарности

Мы благодарим наших коллег Марка Маллигана, Адила Мохамеда, Марен де Врис, Майке Диттманн, Бенджамина Э. Нильссона-Пайанта и Бенджамина. десять за то, что поделились критически важными реагентами и приборами, а также за очень щедрую помощь при первоначальном заражении. учебы в чрезвычайных обстоятельствах. Мы также благодарим Zhen Wei за помощь с ExomePeak2 и Нью-Йоркским университетом. (NYU) Langone Health Genome Technology Center (RRID: SCR_017929) и лаборатории микроскопии (RRID: SCR_017934) для доступа к секвенирования и конфокальной микроскопии соответственно.Эти общие ресурсы частично поддерживаются Службой поддержки онкологического центра. Грант (P30CA016087) Онкологическому центру Лауры и Исаака Перлмуттеров. Эта работа была поддержана грантами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (AI152543, AI073898 и AI151358) и Национальный институт общих медицинских наук (GM056927) и финансирование исследований, связанных с COVID, от NYU Langone Health. Р.К.Г. поддерживался T32 AI100853 и L.Т. был поддержан T32 AI007180.

Вклад авторов : H.M.B., D.P.D., L.T., K.P.S., R.C.G., E.I.V. и K.A.S. проводили эксперименты. В.П.Б. и AH выполнили синтез соединения и анализ. Д.П.Д. и Дж.С.А. выполнил анализ секвенирования Illumina и Nanopore. HMB, DPD, MRA, TK, ACW, и I.M. разработали эксперименты, обсудили результаты, проанализировали данные и помогли H.MB, ACW и IM пишут рукопись.

Простое использование плоского буфера | Бумага для разработки

Установка и использование

Ссылка на ссылку: blog.51cto.com/onebig/2122019

1、 Знакомство с плоским буфером

Flatbuffers — это кроссплатформенный продукт, выпущенный Google. Он предоставляет несколько языковых интерфейсов и сериализованную библиотеку классов, ориентированную на производительность и использование ресурсов. В настоящее время библиотека классов предоставляет интерфейсы языков C++, C#, C, go, Java, JavaScript, PHP и python.Библиотека сериализованных классов в основном используется для передачи данных мобильных игр и конкретных приложений с высокими требованиями к производительности. Далее мы узнаем, как создать среду flatbuffers и использовать язык Java для выполнения простого примера сериализации.

  • компиляция flatc инструмент

  • Записать файл схемы плоских буферов FBS файл

  • use flatc Инструмент компилирует файл схемы и генерирует заголовочный файл/класс объекта данных соответствующего языка

  • Сериализация объектов с помощью flatbufferbuilder

  • Десериализовать объект данных

Инструмент компиляции flatc

Скачать исходный код flatc

  git clone [электронная почта защищена]:google/flatbuffers.мерзавец
cd плоские буферы/
Sudo cmake - G "UNIX makefiles" // сгенерировать makefile
судо сделать
судо сделать установить
Flatc -- версия // отображать версию  

Запись файла схемы плоских буферов

Основной тип:

Комплексный тип:

  • Массив (в квадратных скобках) [тип] ). вложенные массивы не поддерживаются и могут быть реализованы с таблицей

  • Строка string , поддержка UTF-8 или 7-битного ASCII Другие коды могут быть представлены массивом [байт] или [убайт].

  • Struct поддерживает только базовые типы или вложенные структуры

  • Таблица аналогична структуре, но может поддерживать любой тип

Запись первой тестовой FBS

  блок пространства имен;
​
Таблица Блок {
 идентификатор: длинный;
 хэш: строка;
 флаг: логическое значение;
 ТКС: [Ткс];
}
таблица Тх {
 хэш: строка;
 значение: двойное;
}
​
Блок root_type;  

Ссылка на ссылку: github.com/halfrost/Halfrost-Field…

Go использует плоские буферы

Если файл схемы скомпилирован как go-файл, блок.xml будет сгенерирован Go, файл tx.go

flatc -g myschema.fbs

Установить пакет расширения

  перейти -v github. com/google/flatbuffers/go  
Сериализация данных

Преобразование объектов в двоичные данные

  основной пакет
импорт (
  "ФМТ"
  fbs "letcode/flatbuff/fbs/block"
  плоские буферы "github.com/google/flatbuffers/go"
)
введите блочную структуру {
  Идентификатор int64
  Хэш-строка
  Логический флаг
  Ткс [] Ткс
}
тип Tx структура {
  Хэш-строка
  Значение float64
}
основная функция () {
  txone: = Tx{Hash: "adfadf", значение: 123}
  txtwo: = Tx{Хеш: "adfadf", значение: 456}
  блок: = Блок {Идентификатор: 1, Хэш: "aadd", Флаг: правда,}
  //Инициализировать буфер.Если размер равен 0, емкость будет увеличена автоматически.
  строитель := flatbuffers.NewBuilder(0)
  //Первая транзакция
  txoneh := строитель. Createstring (txone. Hash) // сначала обрабатываем нескалярную строку, чтобы получить смещение
  fbs.TxStart (построитель)
  fbs.TxAddHash(построитель, txoneh)
  fbs.TxAddValue(построитель, txone.Value)
  ntxone := fbs.TxEnd (построитель)
  //Вторая транзакция
  txtwoh: = builder. CreateString(txtwo.Hash)
  fbs.TxStart (построитель)
  fbs.TxAddHash(построитель, txtwoh)
  fbs.TxAddValue(строитель, txtwo.Стоимость)
  ntxtwo := fbs.TxEnd (построитель)
  //блокировать
  //Сначала работаем с не скалярами, такими как массивы и строки
  fbs.BlockStartTxsVector (построитель, 2)
  строитель.PrependUOffsetT(ntxtwo)
  строитель.PrependUOffsetT(ntxone)
  текстовые сообщения: = строитель.EndVector (2)
  bh: = builder.CreateString(block.Hash)
  //Повторная обработка скаляра
  fbs.BlockStart(строитель)
  fbs.BlockAddId(строитель, block.Id)
  fbs.BlockAddHash(построитель, bh)
  fbs.BlockAddFlag(строитель, block.Flag)
  fbs.BlockAddTxs (построитель, txs)
  nb := fbs.BlockEnd (строитель)
  строитель.Готово (примечание)
  буф := строитель. Finishedbytes() // возвращает [] байт
  fmt.Println(buf)
}  

Чтобы сериализовать блок, сначала обработайте нескалярную сериализацию, чтобы получить смещение.

Десериализация

Чтение двоичных данных в объект

  func DecodeToBlock(строка имени файла) Блок {
    вар (
        блок Блок
    )
    buf, ошибка: = ioutil. ReadFile (имя файла)
    если ошибка != ноль {
        паника (ошибка)
    }
    //Входящие бинарные данные
    б := fbs.GetRootAsBlock(buf, 0)
    блокировать.Флаг = б.Флаг()
    block.Hash = строка (b.Hash())
    блок.Id = b.Id()
    лен := b.TxsLength()
    для я := 0; я < лен; я++ {
        tx: = новый (fbs.Tx)
        нтх: = новый (Тх)
        если b.Txs(tx, i) {
            ntx.Hash = строка (tx.Hash())
            ntx.Value = tx.Value()
        }
        block.Txs = добавить (block.Txs, *ntx)
    }
    блок возврата
}  
  1. Производительность кодирования: производительность кодирования flatbuf ниже, чем у protobuf. Среди JSON, protobuf и flatbuf у flatbuf худшая производительность кодирования, а JSON находится между ними.

  2. Длина закодированных данных: обычно передаваемые данные сжимаются. Без сжатия длина данных в плоском буфере самая большая, и причина очень проста. Поскольку двоичный поток заполнен множеством нулей, выровненных по байтам, а исходные данные не требуют специальной обработки сжатия, все данные расширяются еще больше. Независимо от того, сжаты они или нет, длина данных в плоском буфере самая большая. После сжатия JSON длина данных будет аналогична буферу протокола.Буфер протокола сжат из-за собственного кодирования. После сжатия с помощью алгоритмов сжатия gzip длина всегда сводится к минимуму.

  3. Производительность декодирования: плоский буфер представляет собой двоичный формат без декодирования, поэтому производительность декодирования намного выше. Это примерно в сотни раз быстрее, чем protobuf, поэтому он быстрее, чем JSON.

Вывод таков: если вам нужно в значительной степени полагаться на десериализацию, вы можете рассмотреть возможность использования плоского буфера.Protobuf демонстрирует сбалансированную способность во всех аспектах.

Данная работа принимает соглашение СС, при перепечатке необходимо указать автора и ссылку на эту статью